Isolering og kultur af primære muskeratinocytter fra neonatal og voksen mus hud
Summary
Epidermal keratinocytter danner en funktionel hudbarriere og er placeret på forsiden af værtsforsvaret mod eksterne miljøbelastninger. Her beskriver vi metoder til isolering og primærkultur af epidermale keratinocytter fra neonatal og voksen museskind og induktion af terminal differentiering og UVB-udløst inflammatorisk respons fra keratinocytter.
Abstract
Keratinocyten (KC) er den overvejende celletype i epidermis, det yderste lag af huden. Epidermal KC'er spiller en afgørende rolle for at yde hudforsvar ved at danne en intakt hudbarriere mod miljøbelastninger, såsom UVB-bestråling eller patogener, og også ved at starte en inflammatorisk reaktion på disse fornærmelser. Her beskriver vi metoder til at isolere KC'er fra neonatal museskind og fra voksen musestikhud. Vi beskriver også dyrkningsbetingelser ved anvendelse af definerede væksttilskud (dGS) i sammenligning med chelexed føtalt bovint serum (cFBS). Funktionelt viser vi, at både neonatale og voksne KC'er er yderst lydhøre over for høj calciuminduseret terminal differentiering, tæt krydsdannelse og stratificering. Derudover er kultiverede voksne KC'er modtagelige for UVB-udløst celledød og kan frigive store mængder TNF ved UVB-bestråling. Sammen vil de her beskrevne metoder være nyttige for forskere til opsætningen af in vitro- modellerS at studere epidermisk biologi i neonatalmusen og / eller den voksne mus.
Introduction
Huden er det største organ i kroppen med epidermis som det yderste lag. Den epidermis spiller en afgørende rolle for at danne en intakt epidermal barriere for at adskille kroppen fra miljøet og forhindrer dermed vandtab og giver beskyttelse mod miljøbelastninger, såsom allergener, patogener og UVB-eksponering. Epidermis udvikler sig fra et enkelt lag af udifferentierede basale keratinocytter (KC'er) ind i et flerskiktsstratificeret epitel, der består af et basal lag efterfulgt af et spinous lag, granulært lag og stratum corneum. Basal KC'er, der består af både epidermale stamceller og transiteringsforstærkende celler, er proliferative og udifferentierede. Når basale KC'er forlader cellecyklussen, forpligter cellerne sig til differentiering og gradvist migrere mod overfladen af epidermis, ledsaget af modning af cellecelleforbindelser og dannelse af en epidermal permeabilitetsbarriere (EPB). KC'erne ved spinouslaget udtrykker tidligt differentierIonmarkører såsom Keratin 10 (K10); Når KC'erne migrerer til det granulære lag, udtrykker cellerne sen differentieringsmarkører såsom Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) og Involucrin (INV). Ved stratum corneum bliver KC'erne terminalt differentierede corneocytter, som til sidst udvises ved desquamation, idet nye celler erstatter dem.
Calcium betragtes som det mest fysiologiske middel i epidermis og udløser differentiering in vitro og in vivo på en lignende måde. I normale hudepidermier danner calciumioner en karakteristisk "koncentrationsgradient", der stiger i koncentration mod hudoverfladen 1 , 2 , 3 . Kalciumkoncentrationen stiger fra lave niveauer i de laveste underlag (basale og spinøse lag) til en top i det øvre granulære lag og derefter falder til ubetydelige niveauer i det mest overfladiske lag (stratum corneum). Kalciumgradienten udvikler sig også tilfældigt med fremkomsten af en komponentpermeabilitetsbarriere, hvilket understøtter, at calciumsignaler spiller en kritisk rolle for KC-differentiering. In vitro opretholder lavt calcium (0,02-0,1 mM) proliferationen af basale KC'er som et monolag, hvorimod højt calcium (> 0,1 mM) inducerer en hurtig og irreversibel forpligtelse af cellerne til terminal differentiering som demonstreret ved tæt krydsningsdannelse og induktion Af LOR og INV på høj calciumbehandling til de basale KCs 4 , 5 .
Ud over barrieredannelse er epidermale KC'er også en vigtig bestanddel af hudens medfødte immunsystem. Som reaktion på patogener eller beskadigede associerede molekylære mønstre (DAMP'er), der frigives ved UVB-bestråling eller -skade, kan KC'er producere store mængder inflammatoriske cytokiner, såsom TNFa, IL6 og IFNβ, hvilket fører til immunsystemaktivering> 6 , 7 , 8 , 9 . Selvom der kræves korrekt inflammatorisk signalering fra KC'er til patogen clearance, kan ukontrolleret inflammatorisk respons udløse udviklingen af autoinflammatoriske hudsygdomme, såsom psoriasis og rosacea 6 , 8 .
Samlet set spiller KC'er en afgørende rolle for at opretholde den intakte hudbarriere og initierer et immunrespons ved patogeninvasion eller miljøbelastninger. Derfor er primærkultur af epidermale KC'er en nyttig teknik til at studere epitelbiologi, KC-differentiering, såvel som KC-stimulerede medfødte immunresponser. Isolering og kultur af primære musepidermuskulære KC'er kan være en udfordrende proces på grund af KCs modtagelighed og følsomhed over for forskellige eksterne stimulanter. Her beskriver vi en metode til at isolere og dyrke KC'er fra enten neonatal museskind ellerVoksen mus hale hud. Til voksen KC-isolering bruger vi ikke musens dorsale hud, fordi isolering af tilstrækkelige mængder levedygtige KC'er fra dette væv kan være svært af følgende grunde: Først består den voksne dorsale hud i hvilepasen af hårcyklusen (telogen) af en Tynde epidermier med kun 1-2 lag celler, hvilket fører til lav celleudbytte og ineffektiv adskillelse af epidermis fra dermis, hvilket er det kritiske trin for succesfuld KC-isolering. For det andet bidrager den høje hårfollikeldensitet, som er til stede på voksen dorsal hud, yderligere til vanskeligheden ved at adskille epidermier fra dermis. I stedet bruger vi rutinemæssigt halehud som kilde til voksne mus-KC'er, da dette epitel er tykkere med 3-5 lag epidermal KCs. Det har også en lavere hårfollikeltæthed, som ikke forstyrrer epidermiseparationen, hvilket tillader KC-isolering fra en hvilken som helst voksen musestikhud uanset musens alder og hårcyklusstadium. Den isolerede neonaTal KC'er er podet til gelatinebelagte kulturskåle, hvorimod kollagenbelagte skåle anvendes til at frø isolerede voksne KC'er på grund af den svækkede evne hos de voksne celler til at klæbe i forhold til deres neonatale modparter. Til dyrkning af mus-KC'er suppleres lavt calciumbasalt medium med dGS, som indeholder epidermal vækstfaktor (EGF), bovint transferrin, insulinlignende vækstfaktor1 (IGF1), prostaglandin E2 (PGE2), bovint serumalbumin (BSA) og hydrocortison. Mellem 2-4 dage efter den oprindelige plettering kan de fleste af de differentierede KC'er vaskes væk under daglige mediumændringer, og de resterende vedhæftende celler viser typisk brostenmorfologi 4 , prolifererer og udtrykker ikke den tidlige differentieringsmarkør K10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hudens epidermis fungerer som en kritisk barriere for at adskille og beskytte kroppen udefra og beskadige vandfald, patogener, varme og UV-bestråling. KC'erne er epidermis fremherskende cellelinie, og primære kulturer af epidermale KC'er er et nyttigt redskab til at studere og forstå de biologiske processer af barrieredannelse og KCs reaktion på miljøbelastninger in vitro .
Her beskriver vi metoder til at isolere og dyrke primære epidermale KC'er fra neonatal og vo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NATIONAL INSTITUT OF ARTHRITIS AND MUSCULOSKELETAL AND SKIN DISEASES grant (R01AR069653 til Zhang LJ) og National Institutes of Health Support (5T32AR062496-03 til CA).
Materials
| C57BL/6 neonates or adult wildtype mice | Jackson Laboratory | 000664 | Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD. |
| KC basal medium (EpiLife) | Invitrogen, Carlsbad, CA | MEPICF500 | basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2 |
| Defined Growth Supplement (dGS) | Invitrogen, Carlsbad, CA | S0125 | defined growth supplements for culture medium |
| Dispase powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 17105041 | enzyme to dissociate the epidermis from dermis |
| Attachment Factor | Invitrogen, Carlsbad, CA | S006100 | gelatin-based coating material |
| Coating Matrix | Invitrogen, Carlsbad, CA | R011K | Collagen-based coating material |
| TrypLE | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12604-013 | A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet |
| 100 μm Cell Strainer Nylon mesh | Corning | 352360 | |
| CCK-8 cell viability Kit | Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD | CK04-11 | |
| Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II | BD Biosciences, San Jose, CA | 555268 | |
| Corded Hand-Held UV Lamps | Spectronics, Westbury, NY | EB-280C | |
| 8-watt UV tubes | Spectronics, Westbury, NY | BLE-8T312 | |
| Light Inverted Microscope for cell culture | ZEISS, Jena, Germany | Axio Observer | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | BX41 |
References
- Mauro, T., et al. Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE. J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).
- Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M. Ionic calcium reservoirs in mammalian epidermis: ultrastructural localization by ion-capture cytochemistry. J Invest Dermatol. 84 (6), 508-512 (1985).
- Elias, P. M., et al. Formation of the epidermal calcium gradient coincides with key milestones of barrier ontogenesis in the rodent. J Invest Dermatol. 110 (4), 399-404 (1998).
- Hennings, H., et al. Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell. 19 (1), 245-254 (1980).
- Zhang, L. J., Bhattacharya, S., Leid, M., Ganguli-Indra, G., Indra, A. K. Ctip2 is a dynamic regulator of epidermal proliferation and differentiation by integrating EGFR and Notch signaling. J Cell Sci. 125 (Pt 23), 5733-5744 (2012).
- Lai, Y. P., et al. Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury. Nat Med. 15 (12), 1377-1382 (2009).
- Bernard, J. J., et al. Ultraviolet radiation damages self noncoding RNA and is detected by TLR3. Nat Med. 18 (8), (2012).
- Zhang, L. J., et al. Antimicrobial Peptide LL37 and MAVS Signaling Drive Interferon-beta Production by Epidermal Keratinocytes during Skin Injury. Immunity. 45 (1), 119-130 (2016).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-Like Receptor 3 Activation Is Required for Normal Skin Barrier Repair Following UV Damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Borkowski, A. W., et al. Toll-like receptor 3 activation is required for normal skin barrier repair following UV damage. J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).
- Zillessen, P., et al. Metabolic role of dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) in primary human (pre)adipocytes. Sci Rep. 6, 23074 (2016).
- Wells, C. A., et al. The macrophage-inducible C-type lectin, mincle, is an essential component of the innate immune response to Candida albicans. J Immunol. 180 (11), 7404-7413 (2008).
- Vasioukhin, V., Bauer, C., Yin, M., Fuchs, E. Directed actin polymerization is the driving force for epithelial cell-cell adhesion. Cell. 100 (2), 209-219 (2000).
- Zhuang, L., et al. TNF receptor p55 plays a pivotal role in murine keratinocyte apoptosis induced by ultraviolet B irradiation. J Immunol. 162 (3), 1440-1447 (1999).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nat Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).
- Dlugosz, A. A., Glick, A. B., Tennenbaum, T., Weinberg, W. C., Yuspa, S. H. Isolation and utilization of epidermal keratinocytes for oncogene research. Methods Enzymol. 254, 3-20 (1995).
- Jones, J. C. Isolation and culture of mouse keratinocytes. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Pirrone, A., Hager, B., Fleckman, P. Primary mouse keratinocyte culture. Methods Mol Biol. 289, 3-14 (2005).
- Yuspa, S. H., Kilkenny, A. E., Steinert, P. M., Roop, D. R. Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracellular calcium concentrations in vitro. J Cell Biol. 109 (3), 1207-1217 (1989).
- Yuspa, S. H., et al. Signal transduction for proliferation and differentiation in keratinocytes. Ann N Y Acad Sci. 548, 191-196 (1988).
- Fang, N. X., et al. Calcium enhances mouse keratinocyte differentiation in vitro to differentially regulate expression of papillomavirus authentic and codon modified L1 genes. Virology. 365 (1), 187-197 (2007).
- Kolly, C., Suter, M. M., Muller, E. J. Proliferation, cell cycle exit, and onset of terminal differentiation in cultured keratinocytes: pre-programmed pathways in control of C-Myc and Notch1 prevail over extracellular calcium signals. J Invest Dermatol. 124 (5), 1014-1025 (2005).
- Marcelo, C. L., Gold, R. C., Fairley, J. A. Effect of 1.2 mmol/l calcium, triamcinolone acetonide, and retinoids on low-calcium regulated keratinocyte differentiation. Br J Dermatol. 111, 64-72 (1984).
