אנו מתארים שיטה מבוססת HPLC לקביעת חומצה N-acetylneuraminic ו- N-glycolylenuraminic חומצה בכבד העכבר חלב.
CMAH (cytidine monophosphate-N-Acetylneuraminic acid hydroxylase) הוא אחראי על החמצון של חומצות cytidine monophosphate-N- אצטילנורמין ב יונקים. עם זאת, בני אדם לא יכולים לחמצן cytidine monophosphate-N- חומצה אצטילנוראמית כדי cytidine monophosphate-N- חומצה glycolylneuraminic בשל מחיקת אקסון העיקרי של הגן CMAH . כדי להבין את ההשפעות ואת ההשלכות של חוסר פעילות CMAH בפירוט רב יותר, מודל Cmah לדפוק את העכברים הוא עניין רב במחקר בסיסי ויישומי. שיטת ניתוח כדי לקבוע את הפנוטיפ של מודל העכבר כאן הוא תיאר בפירוט, והוא מבוסס על זיהוי של שניהם חומצה N-acetylneuraminic ו- N-glycolylenuraminic חומצה בכבד וחלב של wild-type ו- Cmah לדפוק את העכברים. חומצות sialic אנדוגניים משתחררים ו derivatized עם o-phenylenediamine לייצר נגזרות fluorogenic, אשר ניתן לנתח לאחר מכן על ידי HPLC. הפרוטוקול המוצג יכול להיותחל גם על ניתוח של דגימות חלב ורקמות ממקורות שונים אחרים, והוא עשוי להיות שימוש כדי לחקור את התזונתיים ואת ההשפעות הבריאותיות של N-glycolylneuraminic חומצה.
N-Acetylneuraminic חומצה (Neu5Ac) ו- N-glycolylneuraminic חומצה (Neu5Gc) הם חומצות sialic הנפוצים ביותר יונקים 1 . למרות יכולת סינתזה Neu5Ac endogenously, בני אדם אינם מסוגלים לייצר Neu5Gc בשל מחיקת אקסון העיקרי על קידוד הגן CMAH עבור הידרוקסילאז CMP-Neu5Ac 2 , 3 . עם זאת, מוצרי מזון המבוססים על בעלי חיים יכולים להיות מקורות תזונתיים של Neu5Gc 4 , 5 , 6 , המוביל לייצור נוגדנים נוגדי Neu5Gc ולכן מפעיל תגובה חיסונית כלפי Neu5Gc 7 . השפעה זו תזונתית של Neu5Gc חשוד לתרום דלקת כרונית ומחלות שונות 8 , 9 , 10 . על מנת להבין את ההשפעות של Neu5Gc ב חUmans, מודל חיה עבור המחקר השיטתי של ההשפעות של חומצות סיאליות במזון הוא רצוי מאוד. למרות פרוטוקולים המבוססים על תגובת שרשרת פולימראז (PCR) לניתוח של נוק- out עכברים מבוססים היטב דרך נוחה להערכה genotypical, ניתוח פונקציונלי של פנוטיפ ברמה המטבולית דורש שיטות ניתוח ספציפי יותר. פנוטיפ של מודל Cmah לדפוק את העכבר ניתן להעריך על ידי בידוד וניתוח הרכב של חומצות sialic בדגימות כבד או חלב. מספר שיטות לאיתור חומצות סיאליות ברקמות בעלי חיים דווחו בעבר: תגובה של חומצות סיאליות עם רסורצינול 11 או חומצה thiobarbituric 12 לגרום להיווצרות של מוצר chromophoric וניתן פשוט ניתח באמצעות ההתקנה מבוסס platereader, אבל רק את סך sialic ניתן לקבוע תוכן חומצי. לחלופין, ניתוח של חומצות sialic תוארה גם באמצעות כרומטוגרפיה גז13 , MALDI-ToF ספקטרומטריית מסה 14 או שיטות אמפומטריות 15 . עם זאת, הנפוץ ביותר sialic החלים שיטות ניתוח מבוססים על שחרור hydrolytic, ואחריו derivatization פלואורסצנטי ואחריו ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית 16 , 17 , 18 .
הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר הערכה פנוטיפית של הומוזיגוס Cmah לדפוק את העכברים על ידי ניתוח וכימות כמויות יחסית של Neu5Gc של חלב ודגימות כבד. הניתוח בוצע באמצעות התקנה סטנדרטית HPLC עם זיהוי פלואורסצנטי. השלב הקריטי ביותר של הליך זה הוא הכנת העמודות חילופי אניון וביצוע כ?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי הקרן למדעי הטבע של סין (מענק מספרים 31471703, A0201300537 ו 31671854 ל JV ו LL), ואת 100 תוכנית כשרונות זרים (מענק מספר JSB2014012 ל JV).
Chemicals: | |||
N-acetylneuraminic acid | Sigma | A0812 | |
N-glycolylneuraminic acid | Sigma | 50644 | 1 mg aliquot should be sufficient |
o-Phenylenediamine | Sigma | 694975 | |
Sodium hydrogen sulfite | J&K Scientific Ltd | 75234 | |
Tools/Materials: | |||
3 mL SPE tubes | Supelco | Sigma 57024 | empty solid phase extraction columns |
Luer stopcock | Sigma | S7396 | to stop the flow of the SPE tube |
Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200-400 mesh |
Dounce tissue grinder | Sigma | D8938 | tight fit |
HPLC Analysis: | |||
High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
HPLC Column | Phenomenex | Hyperclone ODS | 250×4.6 mm |
LCMS-grade H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | #100029 | Hypergrade |
Ammonium hydroxide solution | Fluka | #44273 | puriss. P.a. |