हम माउस लिवर और दूध में एन-एसिटीन्यूरिनमिक एसिड और एन-ग्लाइकोलेनुर्मेनिक एसिड के निर्धारण के लिए एक एचपीएलसी आधारित पद्धति का वर्णन करते हैं।
सीएमएएच (साइथिडिन मोनोफोस्फेट-एन-एसिटाइलेनमैनिनिक एसिड हाइड्रोक्साइलेज) स्तनपायी में साइटिडाइन मोनोफोस्फेट-एन-एसिटाइलेनेमैनिक एसिड के ऑक्सीकरण के लिए जिम्मेदार है। हालांकि, सीएमएएच जीन के प्राथमिक एक्सीन विलोपन के कारण मानव साइटिडिन मोनोफोसाफ्टी-एन-एसिटालेनमरामिनी एसिड को साइटिडाइन मोनोफोस्फेट-एन-ग्लाइकोलाइनेरमिनिक एसिड में ऑक्सीकरण नहीं कर सकते। अधिक विस्तार से सीएमएएच गतिविधि की कमी के प्रभावों और प्रभावों को समझने के लिए, चूहों में एक सीएमए दस्तक आउट मॉडल मूल और व्यावहारिक अनुसंधान में गहरी रुचि का है। इस माउस मॉडल के phenotype को निर्धारित करने के विश्लेषण विधि को यहाँ विस्तार से वर्णित किया गया है, और यह एन-एसिटीन्युरमिनिक एसिड और एन-ग्लाइकोलेनुर्मेनिकिक एसिड दोनों का पता लगाने और जंगली प्रकार के दूध और सीएमह दस्तक-चूहों के दूध पर आधारित है । अंतर्जात sialic एसिड को छोड़ दिया जाता है और ओ-फेनिलेनेडाइनिन के साथ फ्लोरोजेनिक डेरिवेटिव उत्पन्न होता है, जिसे बाद में एचपीएलसी द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल हो सकता हैविभिन्न अन्य मूलों से दूध और ऊतक नमूनों के विश्लेषण के लिए भी आवेदन किया है, और एन-ग्लाइकोलाइनेमिनिक एसिड के पोषण और स्वास्थ्य प्रभावों की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
एन-एसिटाइलेनेमिनिक एसिड (Neu5Ac) और एन-ग्लाइकॉलन्यूरमिनिक एसिड (Neu5Gc) सबसे अधिक स्तनपायी 1 में सबसे आम sialic एसिड हैं। यद्यपि Neu5Ac अंतर्जात रूप से संश्लेषण करने में सक्षम हैं, मानव CMU-Neu5Ac हाइड्रॉक्सीलेज़ 2 , 3 के लिए सीएमएएच जीन एन्कोडिंग पर प्राथमिक एक्सीन हटाने के कारण Neu5Gc पैदा करने में सक्षम नहीं हैं। हालांकि, पशु-आधारित खाद्य उत्पादों Neu5Gc 4 , 5 , 6 के आहार स्रोत हो सकते हैं , जो एंटी Neu5Gc एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए अग्रणी हैं और इसलिए Neu5Gc 7 के प्रति प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को गति प्रदान करता है। Neu5Gc के इस आहार प्रभाव को पुरानी सूजन और विभिन्न अन्य रोगों 8 , 9 , 10 में योगदान करने के लिए संदेह है। एच में Neu5Gc के प्रभावों को व्यापक रूप से समझने के लिएUmans, एक पशु मॉडल, भोजनजन्य sialic एसिड के प्रभावों के व्यवस्थित अध्ययन के लिए बहुत ही वांछनीय है यद्यपि नाक-आउट चूहों के विश्लेषण के लिए पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) पर आधारित प्रोटोकॉल अच्छी तरह से स्थापित हैं और जीनाटिकल मूल्यांकन के लिए एक सुविधाजनक तरीका है, चयापचय स्तर पर फेनोटाइप के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए अधिक विशिष्ट विश्लेषण विधियों की आवश्यकता होती है। सीमाह दस्तक आउट माउस मॉडल की फीनोटाइप को लीवर या दूध के नमूनों में सैसिल एसिड की संरचना को पृथक और विश्लेषण करके मूल्यांकन किया जा सकता है। जानवर के ऊतकों में सियालिक एसिड का पता लगाने के लिए कई तरीके पहले से सूचित किये गये हैं: रेमोसीनॉल 11 या थिओबर्बिटुरिक एसिड के साथ एक क्रोमोफोरिक उत्पाद के गठन में 12 परिणाम और एक प्लेटिडर आधारित सेटअप का आसानी से विश्लेषण किया जा सकता है, लेकिन केवल कुल सैसिल एसिड सामग्री निर्धारित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, सीलिक एसिड का विश्लेषण गैस क्रोमैटोग्राफी का भी वर्णन किया गया था13 , माल्डी-टूफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री 14 या एम्परमेट्रिक मेथड्स 15 हालांकि, सबसे अधिक लागू सिलिका एसिड विश्लेषण विधियों हाइड्रोलाइटिक रिलीज पर आधारित हैं, इसके बाद प्रतिदीप्ति व्युत्पत्तिकरण और बाद में उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी 16 , 17 , 18 ।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल ने नीयू 5 जीसी के दूध और यकृत के नमूनों की सापेक्ष मात्रा का विश्लेषण और मात्रा बढ़ाकर homozygous Cmah दस्तक आउट चूहों के फेनोटाइपिकल मूल्यांकन की अनुमति दी है। विश्लेषण प्रत?…
The authors have nothing to disclose.
यह काम चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 31471703, ए 0010300537 और 31671854 जेवी और एलएलएल), और 100 विदेशी प्रतिभा योजना (जेवी को अनुदान संख्या जेएसबी2014012) द्वारा भाग में समर्थित था।
Chemicals: | |||
N-acetylneuraminic acid | Sigma | A0812 | |
N-glycolylneuraminic acid | Sigma | 50644 | 1 mg aliquot should be sufficient |
o-Phenylenediamine | Sigma | 694975 | |
Sodium hydrogen sulfite | J&K Scientific Ltd | 75234 | |
Tools/Materials: | |||
3 mL SPE tubes | Supelco | Sigma 57024 | empty solid phase extraction columns |
Luer stopcock | Sigma | S7396 | to stop the flow of the SPE tube |
Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200-400 mesh |
Dounce tissue grinder | Sigma | D8938 | tight fit |
HPLC Analysis: | |||
High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
HPLC Column | Phenomenex | Hyperclone ODS | 250×4.6 mm |
LCMS-grade H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | #100029 | Hypergrade |
Ammonium hydroxide solution | Fluka | #44273 | puriss. P.a. |