Determinación de ácidos siálicos en hígado y muestras de leche de tipo salvaje y<em> CMAH</em> Ratones knock-out.
Summary
Se describe un método basado en HPLC para la determinación de ácido N-acetilneuramínico y ácido N-glicolilenuramínico en hígado y leche de ratón.
Abstract
El CMAH (citidina monofosfato-N-acetilneuramínico hidroxilasa) es responsable de la oxidación de citidina monofosfato-N-acetilneuramínico en mamíferos. Sin embargo, los seres humanos no pueden oxidar el ácido monofosfato de citidina-N-acetilneuramínico a ácido monofosfato de citidina-N-glicolilneuramínico debido a una deleción del exón primario del gen CMAH . Para entender los efectos y las implicaciones de la falta de actividad de CMAH con más detalle, un modelo de eliminación de Cmah en ratones es de gran interés en la investigación básica y aplicada. El método de análisis para determinar el fenotipo de este modelo de ratón se describe aquí en detalle y se basa en la detección de ácido N-acetilneuramínico y ácido N-glicolilenuramínico en el hígado y leche de ratones knock-out de tipo salvaje y Cmah . Los ácidos siálicos endógenos se liberan y se derivatizan con o-fenilendiamina para generar derivados fluorogénicos, que pueden analizarse posteriormente por HPLC. El protocolo presentado puede serTambién se aplicó para el análisis de leche y muestras de tejidos de otros orígenes, y puede ser útil para investigar los efectos nutricionales y para la salud del ácido N-glicolilneuramínico.
Introduction
El ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) y el ácido N-glicolilneuramínico (Neu5Gc) son los ácidos siálicos más comunes en la mayoría de los mamíferos 1 . Aunque son capaces de sintetizar endógenamente Neu5Ac, los seres humanos no son capaces de producir Neu5Gc debido a una deleción primaria de exón en el gen CMAH que codifica para una hidroxilasa 2 , 3 de CMP-Neu5Ac. Sin embargo, los productos alimenticios de origen animal pueden ser fuentes dietéticas de Neu5Gc 4 , 5 , 6 , lo que conduce a la producción de anticuerpos anti-Neu5Gc y por lo tanto, desencadenar una respuesta inmune hacia Neu5Gc 7 . Se sospecha que este efecto en la dieta de Neu5Gc contribuye a la inflamación crónica ya otras diversas enfermedades 8 , 9 , 10 . Con el fin de comprender ampliamente los efectos de Neu5Gc en hUn modelo animal para el estudio sistemático de los efectos de los ácidos siálicos transmitidos por los alimentos es altamente deseable. Aunque los protocolos basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el análisis de ratones knock-out están bien establecidos y una manera conveniente para la evaluación genotípica, el análisis funcional del fenotipo en el nivel metabólico requiere métodos de análisis más específicos. El fenotipo de un modelo de ratón knock-out Cmah se puede evaluar aislando y analizando la composición de ácidos siálicos en muestras de hígado o leche. Varios métodos para la detección de ácidos siálicos en tejidos animales han sido reportados previamente: la reacción de ácidos siálicos con resorcinol 11 o ácido tiobarbitúrico 12 da como resultado la formación de un producto cromóforo y puede analizarse simplemente usando una configuración basada en platereader, pero sólo la sialic total Se puede determinar el contenido de ácido. Alternativamente, el análisis de ácidos siálicos también se describió usando cromatografía de gases13 , espectrometría de masas MALDI-ToF 14 o métodos amperométricos 15 . Sin embargo, los métodos de análisis de ácido siálico más comúnmente aplicados se basan en la liberación hidrolítica, seguido por derivatización de fluorescencia y cromatografía líquida subsiguiente de alto rendimiento 16 , 17 , 18 .
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo presentado aquí permite la evaluación fenotípica de ratones knock-out homocigóticos Cmah analizando y cuantificando las cantidades relativas de Neu5Gc de leche y muestras de hígado. El análisis se realizó utilizando una configuración de HPLC estándar con detección de fluorescencia. El paso más crítico de este procedimiento es la preparación de las columnas de intercambio aniónico y la realización de la cromatografía de intercambio aniónico; Para sedimentar la resina adecua…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación de Ciencias Naturales de China (los números de subvención 31471703, A0201300537 y 31671854 a JV y LL), y el plan de 100 Talentos Extranjeros (concesión número JSB2014012 a JV).
Materials
| Chemicals: | |||
| N-acetylneuraminic acid | Sigma | A0812 | |
| N-glycolylneuraminic acid | Sigma | 50644 | 1 mg aliquot should be sufficient |
| o-Phenylenediamine | Sigma | 694975 | |
| Sodium hydrogen sulfite | J&K Scientific Ltd | 75234 | |
| Tools/Materials: | |||
| 3 mL SPE tubes | Supelco | Sigma 57024 | empty solid phase extraction columns |
| Luer stopcock | Sigma | S7396 | to stop the flow of the SPE tube |
| Dowex 1X8 | Dow Chemicals | Sigma 44340 | 200-400 mesh |
| Dounce tissue grinder | Sigma | D8938 | tight fit |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | #5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| HPLC Column | Phenomenex | Hyperclone ODS | 250×4.6 mm |
| LCMS-grade H2O | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | #100029 | Hypergrade |
| Ammonium hydroxide solution | Fluka | #44273 | puriss. P.a. |
References
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