Transplantation de cellules germinales primordiales pour base CRISPR/Cas9 saute-mouton chez Xenopus

Summary

Gènes essentiels à la survie posent des obstacles techniques pour créer des lignées mutantes. Saute-mouton contourne la létalité en combinant génome édition avec la transplantation de cellules germinales primordiales pour créer des animaux sauvage porteurs de mutations germinales. Brûler les étapes permet également la génération efficace des homozygotes mutants null dans la génération de₁ F. Ici, l’étape de la transplantation est démontrée.

Abstract

La création de lignées mutantes en éditant de génome s’accélère l’analyse génétique chez de nombreux organismes. Méthodes CRISPR/Cas9 ont été adaptés à l’africaine Xenopus laevis, Xenopus, un organisme modèle de longue date pour la recherche biomédicale. Régimes de reproduction traditionnelle pour la création de lignées mutantes homozygotes avec mutagénèse CRISPR/Cas9-ciblés ont plusieurs étapes longues et laborieuses. Pour faciliter la création d’embryons mutants, notamment pour surmonter les obstacles associés à assommer les gènes qui sont essentiels pour l’embryogénèse, une nouvelle méthode appelée Bond a été développée. Cette technique s’appuie sur la robustesse des embryons de Xenopus à « copier / coller » méthodes embryologiques. Saute-mouton utilise le transfert de cellules germinales primordiales (PGC) provenant d’embryons de donneurs efficacement-mutagénisées tant en frères et sœurs PGC-ablation de type sauvage. Cette méthode permet une mutation efficace de gènes essentiels en créant des animaux chimériques avec cellules somatiques de type sauvage qui transportent un mutant germline. Lorsque deux animaux de₀ F porteurs « leapfrog greffes » (c'est-à-dire, les cellules germinales mutant) sont intercroisées, ils produisent des homozygotes, ou hétérozygotes, null F₁ embryons, sauvant ainsi un temps de génération complet pour obtenir des données phénotypiques. Saute-mouton fournit également une nouvelle approche pour l’analyse des gènes effet maternel qui sont réfractaires à l’analyse phénotypique₀ F suite CRISPR/Cas9 mutagenèse. Ce manuscrit détaille la méthode de brûler les étapes, avec un accent particulier sur la façon de réaliser avec succès la transplantation du PGC.

Introduction

Comment le génotype encode phénotype a été une question majeure en biologie depuis la redécouverte des lois de Mendel. Comprendre les rôles des gènes, leur régulation et interactions au sein des réseaux de gènes et les fonctions des promesses de produits codés de fournir des outils pour découvrir nouvelle biologie et amélioration des états pathologiques. Pour plus d’un demi siècle¹, l’africaine Xenopus laevis, Xenopus, a été un modèle pour les études sur un large éventail de sujets en biologie fondamentale et de la biomédecine, y compris le contrôle génétique du développement. Historiquement, la plupart des recherches sur Xenopus

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité de l’urbanisme de l’Université de Californie, Irvine et d’institutionnels animalier.

1. les préparations destinés à la Transplantation de PGC

1. Préparer des outils de dissection à l’avance, comme décrit précédemment²³.
   NOTE : Couteaux de cheveux sourcil servent à faire des incisions avec l’aide d’une boucle de cheveux pour stabiliser l’embryon tout en effectuant les chirurgies. Poils des sourcils et des boucles de cheveux sont collés en verre borosilicaté, pipettes Pasteur qui ont d’abord été attiré dans une flamme et cassés sur la partie ami....

Results

Après la transplantation, la détermination qualitative de l’efficacité de la mutagénèse CRISPR/Cas9 doit être effectuée avant de dépenser de l’effort dans l’élevage pour développer et maintenir les animaux à la maturité sexuelle. Parce que les animaux porteurs de leapfrog greffes est somatiquement type sauvage et la lignée germinale est difficile d’accès pour des mesures directes, il devient important de sauver les carcasses d’embryons de donneurs. Analyse de l’ADN de la carcasse fait off.......

Discussion

Ce rapport fournit un protocole détaillé pour la transplantation de tissu végétal contenant PGC. Transplantation de PGC est utilisé en conjonction avec les technologies de modification du génome (p. ex., CRISPR/Cas9) pour modifier les cellules germinales d’un animal tout en maintien de la quasi-totalité de ses tissus somatiques comme génétiquement le type sauvage. Pour brûler les étapes pour réussir, il y a un certain nombre de facteurs critiques à considérer avant d’effectuer des transplantations d’organes.

.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pince Dumont #5	Outils scientifiques fins	11252-20 ou 11252-30
		cheveux pour sourcils	Boucle
			Pipettes Pasteur maison
, verre borosilicaté	Fisher Scientific	13-678-20A
Colle Krazy (à base de cyanoacrylate)	Elmer’s Products, Inc.	KG581	Pour fixer les cheveux des sourcils et les boucles de cheveux dans les pipettes Pasteur, d’autres colles similaires peuvent être utilisées.
Oligodésoxynucléotides, technologies	d’ADN intégrées	commandées sur mesure Oligos modèles commandés sur mesure pour la synthèse de l’ARNsg, voir Nakayama et al., 2014 pour les détails de conception.
Kit Megascript T7	Ambion/ThermoFisher	AM1334	Ou utilisez le kit Megashortscript T7 (AM1354)
Phénol, tampon			Phénol distillé de haute qualité de n’importe quel fournisseur commercial
Chloroforme			de haute qualité de n’importe quel fournisseur commercial
Éthanol			haute qualité de n’importe quel fournisseur commercial
Diéthylpyrocarbonate (DEPC)	Sigma Chemical Co.	D5758-50ML
Protéine Cas9, avec signal de localisation nucléaire	PNA Bio, Inc.	CP01	Reconstitué à partir d’eau traitée au DEPC selon les recommandations du fabricant
10X la solution			de Marc Maison. La recette (ref 26) pour 1X MMR (sans EDTA) est de 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Le pH de la solution est ajusté à 7,4.
Agarose			N’importe quelle agarose de qualité biologie moléculaire est suffisante
60 X15 mm Plaques de Pétri	Falcon	351007
24 puits	Falcon	3047
L-Cysteine	Sigma Chemical Co.	C7352-100G	Base libre, pas de sel HCl
Protéinase K	Roche	03 115 828 001	Généralement ~20mg/ml de Roche
sera Micron	sera		Tadpole food. Remettre en suspension dans le milieu de croissance. Peut être acheté auprès d’une variété de détaillants en ligne