Morphogenesis और भ्रूण और प्रसवकालीन महाधमनी के रोगजनन का अध्ययन करने के लिए Vivo और ऊतक और सेल Explant दृष्टिकोण में का उपयोग करना
Summary
vivo क्लोनल विश्लेषण और भाग्य मानचित्रण, महाधमनी explants, और पृथक चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं में उपयोग कर भ्रूण और प्रसवकालीन murine महाधमनी का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल यहां विस्तृत रहे हैं । ये विविध दृष्टिकोण सामान्य विकास में भ्रूण और प्रसवकालीन महाधमनी के morphogenesis की जांच की सुविधा और रोग में रोगजनन.
Abstract
महाधमनी शरीर में सबसे बड़ी धमनी है । महाधमनी दीवार endothelial कोशिकाओं की एक भीतरी परत, लोचदार lamellae और चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (SMCs) बारी की एक मध्यम परत, और fibroblasts और extracellular मैट्रिक्स की एक बाहरी परत से बना है । वयस्क महाधमनी में रोग मॉडल (जैसे, atherosclerosis) के व्यापक अध्ययन के विपरीत, बहुत कम भ्रूण और प्रसवकालीन महाधमनी के बारे में जाना जाता है । यहां, हम SMCs पर ध्यान केंद्रित करने और सामांय विकास और रोग में भ्रूण और प्रसवकालीन महाधमनी SMCs के morphogenesis और रोगजनन के विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । विशेष रूप से, चार प्रोटोकॉल शामिल हैं: i) vivo भ्रूण भाग्य मानचित्रण और क्लोनल विश्लेषण में ; ii) explant भ्रूण महाधमनी संस्कृति; iii) प्रसवकालीन महाधमनी से एसएमसी अलगाव; और iv) चमड़े के नीचे परासरणी मिनी-गर्भवती (या गैर-गर्भवती) चूहों में पंप प्लेसमेंट । इस प्रकार, इन तरीकों के मूल (ओं) की जांच की सुविधा, भाग्य, और SMCs के क्लोनल वास्तुकला में महाधमनी में vivo। वे औषधीय एजेंटों के लिए सतत जोखिम से utero में भ्रूण महाधमनी morphogenesis के नियमन के लिए अनुमति देते हैं । इसके अलावा, पृथक महाधमनी ऊतक explants या महाधमनी SMCs जैसे muscularization, प्रसार, और प्रवास के रूप में मौलिक प्रक्रियाओं के दौरान विशिष्ट जीन लक्ष्यों की भूमिका में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इन परिकल्पना-अलग SMCs और explanted महाधमनी पर प्रयोगों पैदा कर सकते है तो vivo में संदर्भ में औषधीय और आनुवंशिक दृष्टिकोण के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है ।
Introduction
कोशिकीय जीवों के संचार प्रणालियों कोशिकाओं है कि बाहरी वातावरण के साथ संपर्क में नहीं है और इन कोशिकाओं से अपशिष्ट उत्पादों और कार्बन डाइऑक्साइड को दूर करने के लिए पोषक तत्वों और ऑक्सीजन देने के लिए कार्य करते हैं । रीढ़ में, प्राथमिक संचार प्रणाली दिल है, जो रक्त वाहिकाओं की एक श्रृंखला के माध्यम से रक्त पंप के होते हैं । बड़ी रक्त वाहिकाओं की दीवारों, इस तरह के धमनियों और नसों के रूप में, तीन परतों से मिलकर बनता है: i) intima, या endothelial कोशिकाओं की भीतरी परत; ii) मीडिया, या मध्यम परत की बारी circumferentially लम्बी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं SMCs और लोचदार lamellae; और iii) adventitia, या संयोजी ऊतक और fibroblasts की बाहरी परत । endothelial कोशिकाओं पर संवहनी जीवविज्ञान ध्यान में अध्ययन के विशाल बहुमत, नए endothelial सेल के गठन की जांच angiogenesis के माध्यम से ट्यूब लाइन में खड़ा । इसकी तुलना में, SMCs अपेक्षाकृत कम ध्यान प्राप्त करते हैं । हालांकि, SMCs सामान्य धमनी दीवार के निर्माण में और संवहनी विकृतियों में एक महत्वपूर्ण कोशिका प्रकार हैं ।
महाधमनी दिल के बाईं निलय से हृदय उत्पादन प्राप्त करने, शरीर में सबसे बड़ा कैलिबर धमनी है । यह atherosclerosis, धमनीविस्फार, और विच्छेदन सहित विविध मानव रोगों से पीड़ित है । वयस्क जीवों में, महाधमनी और इसकी प्रमुख शाखाओं में संवहनी रोग के मॉडलों में तीव्रता से अध्ययन किया जाता है । उदाहरण के लिए, उच्च वसा वाले आहार चूहों कि कम घनत्व लिपोप्रोटीन रिसेप्टर या apolipoprotein ई एंकोडिंग जीन के लिए नल हैं, atherosclerosis विकसित करने, और हाल ही में भाग्य मानचित्रण अध्ययन संकेत मिलता है कि पूर्व मौजूदा SMCs में कई प्रकार के सेल को जंम दे atherosclerotic पट्टिका1. महाधमनी aneurysms में, रोग परिवर्तन एसएमसी apoptosis और extracellular मैट्रिक्स remodeling2,3शामिल हैं ।
काफी कम भ्रूण और प्रसवकालीन अवधि के दौरान एसएमसी morphogenesis और रोगजनन के बारे में जाना जाता है । यहाँ, हम vivo मेंभ्रूण और प्रसवकालीन महाधमनी SMCs का अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, ऊतक explants में और अलग कोशिकाओं में. उदाहरण के लिए, प्रोटोकॉल के पहले खंड रूपरेखा भाग्य मानचित्रण और भ्रूण चूहों में क्लोनल विश्लेषण । Cre recombinase एक कोशिका विशेष प्रवर्तक के नियंत्रण में व्यक्त विशिष्ट कोशिकाओं और उनकी संतान के अंकन की सुविधा4,5,6; हालांकि, सेल विशेष लेबलिंग के अस्थाई नियंत्रण चूहों में भ्रूण के विकास के दौरान चुनौतीपूर्ण हो सकता है । इस संदर्भ में, SMCs में सक्रिय एक प्रवर्तक के तहत सशर्त CreER व्यक्त भ्रूण के साथ (जैसे, Myh11 या Acta2) और एक Cre रिपोर्टर, हम tamoxifen या उसके सक्रिय metabolite इंजेक्शन के लिए तरीके प्रदान करते हैं 4-OH-tamoxifen गर्भवती बांधों में और भ्रूण या प्रसव वंश में लेबल कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए । इसके अलावा, भाग्य मानचित्रण अध्ययन है, जो predominately एक रिपोर्टर fluorophore के साथ Cre संवाददाताओं का उपयोग करने के विपरीत में1,7, क्लोनल विश्लेषण काफी बहु रंग Cre पत्रकारों के साथ बढ़ाया है ।
प्रोटोकॉल के दूसरे और तीसरे वर्गों अलग और संवर्धन भ्रूण महाधमनी explants और SMCs से महाधमनी नवजात, क्रमशः के लिए तरीकों का वर्णन । इन तरीकों संकेतन रास्ते के हेरफेर के लिए अनुमति देते हैं, विशेष रूप से महाधमनी explants या SMCs में, और औषधीय एजेंटों के प्रत्यक्ष प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए । इस प्रकार, ब्याज के ऊतकों में विशिष्ट जीन की भूमिका चूहों में पारंपरिक आनुवंशिक जोड़तोड़ के माध्यम से कहीं अधिक तेजी से फैशन में दिखलाई जा सकता है । इसके अलावा, पृथक एसएमसी अध्ययन सेल प्रवासन और आसंजन, जो vivo मेंतकनीकी रूप से सीमित कर रहे है के विश्लेषण की सुविधा ।
अंत में, चौथा प्रोटोकॉल अनुभाग एक चमड़े के नीचे परासरणी मिनी-गर्भवती (या गैर गर्भवती) चूहों में औषधीय एजेंटों के साथ भरी हुई पंप के स्थान रूपरेखा । इस विधि क्योंकि तेजी से चयापचय की सतत अर्क की आवश्यकता होती है कि एजेंटों की वजह से भ्रूण विकास पर प्रभाव के विश्लेषण की सुविधा । अक्सर इंजेक्शन के वैकल्पिक कई एजेंटों के लिए व्यावहारिक नहीं है और बचा जाना चाहिए, क्योंकि यह गर्भवती बांध में महत्वपूर्ण असुविधा का कारण हो सकता है ।
Protocol
सभी माउस प्रोटोकॉल येल विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं ।
1. in Vivo भ्रूण किस्मत मानचित्रण और क्लोनल विश्लेषण
नोट: हम इन दृष्ट…
Representative Results
Discussion
atherosclerosis के मॉडल के रूप में वयस्क रोग की स्थिति में murine महाधमनी और इसकी प्रमुख शाखाओं की व्यापक जांच के विपरीत, कम morphogenesis और भ्रूण और रोगजनन प्रसवकालीन के महाधमनी के बारे में जाना जाता है । यहां, हम भ्रूण/प्रस?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम महाधमनी एसएमसी अलगाव के लिए अपनी प्रयोगशाला प्रोटोकॉल बांटने के लिए डीन ली धंयवाद । फंडिंग सहायता राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R21NS088854, R01HL125815, और R01HL133016 को डी. एम. जी.) द्वारा प्रदान की गई थी, अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (ग्रांट-इन-एड 14GRNT19990019 टू D.M.G.), और येल विश्वविद्यालय (ब्राउन-Coxe फेलोशिप टू A.M. एंड स्टार्टअप D.M.G. के लिए फंड) ।
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Corn oil | Sigma | C-8267 | Vehicle for tamoxifen |
| 4-OH-tamoxifen | Sigma | H7904 | Active metabolite of tamoxifen |
| Progesterone | Sigma | P8783-5G | Use at half the concentration of tamoxifen |
| OCT compound | Sakura tissue tek | 4583 | For making cryoblocks |
| Cryomolds | Polysciences inc | 18986 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/ml |
| Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody | Sigma | A2547 | IHC staining of SMA, final dilution 1:500 |
| Anti-CD31 antibody | BD Pharmingen | 550274 | IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/ml |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11121 | IHC staining of CD31, final concentration 0.0016 mg/ml |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 647 | Life Technologies | a21244 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml |
| Secondary antibody goat anti-rabbit, Alexa 488 | Life Technologies | a11008 | IHC staining, final concentration 0.004 mg/ml |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10567-014 | For cell culture |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Anti-integrin beta3 blocking antibody | BD Biosciences | 553343 | Clone 2C9.G2, final concentration 0.02 mg/ml |
| Collagenase | Worthington Biochemical Corp | 44H14977A | For digesting aorta |
| Elastase | Worthington Biochemical Corp | 34K15139 | For digesting aorta |
| Antibiotic-antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Recombinant human FGF | Promega | G5071 | |
| Recombinant human EGF | Promega | G5021 | |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Amphotericin B | Thermo Fisher Scientific | 15290026 | |
| Tissue culture plates | Corning | CLS430165 | |
| Alzet osmotic mini-pump | Durect Corporation | 2001 | |
| ECLIPSE 80i Upright Fluorescent Microscope | Nikon | ||
| TCS SP5 | Leica | ||
| Branson Sonifier 450 | VWR | ||
| Myh11-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 19079 | |
| Acta2-CreERT2 mice | Obtained from lab of Dr. Pierre Chambon and Daniel Metzger | ||
| ROSA26R-CreERT2 mice | The Jackson Laboratory | 8463 | |
| ROSA26R(mTmG/mTmG) mice | The Jackson Laboratory | 026862 | |
| ROSA26R(EYFP/EYFP) mice | The Jackson Laboratory | 006148 | |
| ROSA26R(Confetti/Confetti) mice | The Jackson Laboratory | 13731 | |
| ROSA26R(Rb/Rb) mice | Lab of Dr. Irv Weissman | Obtained from lab of Dr. Irv Weissman |
References
- Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nat Med. 21, 628-637 (2015).
- Rowe, V. L., et al. Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas. J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).
- Rodella, L. F., et al. Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation. Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).
- Lewandoski, M. Conditional control of gene expression in the mouse. Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).
- Lakso, M., et al. Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).
- Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).
- Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension. Cell Rep. 6, 809-817 (2014).
- Greif, D. M., et al. Radial construction of an arterial wall. Dev Cell. 23, 482-493 (2012).
- Misra, A., et al. Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis. J Exp Med. 213, 451-463 (2016).
- Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 7, (2015).
- Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nat Med. 14, 64-68 (2008).
- Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse. Genesis. 47, 14-18 (2009).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
- Kumar, M. E., et al. Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution. Science. 346, 1258810 (2014).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Dev Biol. 1, 4 (2001).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45, 593-605 (2007).
- Li, D. Y., et al. Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis. Nature. 393, 276-280 (1998).
- Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis. Circ Res. 75, 803-812 (1994).
- Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis. Cell. 73, 159-168 (1993).
- Li, D. Y., et al. Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin. J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).
- Li, D. Y., et al. Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis. Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).
- Pober, B. R. Williams-Beuren syndrome. N Engl J Med. 362, 239-252 (2010).
- Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome. J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).
- Holtwick, R., et al. Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).
- Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis. Science. 300, 329-332 (2003).
- Zhang, J., et al. Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).
- Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene. Genesis. 48, 457-463 (2010).
- Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations. Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).
- Yokota, T., et al. Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells. Stem Cells. 24, 13-22 (2006).
