Eine Methode zur Beurteilung von Bakteriocin-Wirkungen auf die Gut-Mikrobiota von Mäusen
Summary
Es wird angenommen, dass Bakteriocine eine Schlüsselrolle bei der Definition der mikrobiellen Vielfalt in verschiedenen ökologischen Nischen spielen. Hier beschreiben wir ein effizientes Verfahren zur Beurteilung, wie sich Bakteriocine in einem Tiermodell auf die Mikrobiota-Zusammensetzung auswirken.
Abstract
Sehr faszinierende Fragen entstehen mit unserem fortschreitenden Wissen über die Mikrobiota-Komposition und die Beziehung zur Gesundheit, insbesondere in Bezug auf die Faktoren, die zur Erhaltung der Populationsbilanz beitragen. Allerdings gibt es begrenzte verfügbare Methoden, um diese Faktoren zu bewerten. Bakteriocine sind antimikrobielle Peptide, die von vielen Bakterien produziert werden, die einen Wettbewerbsvorteil für die Nahrungsmittelerfassung und / oder Nischenherstellung verleihen können. Viele probiotische Milchsäurebakterien (LAB) -Stämme haben ein großes Potenzial, die Gesundheit von Mensch und Tier zu fördern, indem sie das Wachstum von Krankheitserregern verhindern. Sie können auch für die Immunmodulation verwendet werden, da sie Bakteriocine produzieren. Allerdings wird die antagonistische Aktivität von Bakteriocinen normalerweise durch Labor-Bioassays unter wohldefinierten, aber über-vereinfachten Bedingungen im Vergleich zu der komplexen Darm-Umgebung bei Menschen und Tieren bestimmt, wo Bakterien mit multifaktoriellen Einflüssen aus dem Wirt und Hunderten von mikrobiellen Spezies s konfrontiert sindDie gleiche Nische Diese Arbeit beschreibt ein vollständiges und effizientes Verfahren zur Bewertung der Wirkung Einer Vielzahl von Bakteriocinen mit unterschiedlichen Zielspezifitäten in einem murinen System. Änderungen der Mikrobiota-Zusammensetzung während der Bakteriocin-Behandlung werden unter Verwendung einer kompositorischen 16S-rDNA-Sequenzierung überwacht. Unser Ansatz nutzt sowohl die Bakteriocin-Produzenten als auch ihre isogenen Nicht-Bakteriocin-produzierenden Mutanten, wobei letztere die Fähigkeit gibt, Bakteriocin-bezogene von nicht-bakteriocinbezogenen Modifikationen der Mikrobiota zu unterscheiden. Die Fäkal-DNA-Extraktion und die 16S-rDNA-Sequenzierungsmethoden sind konsistent und bilden zusammen mit der Bioinformatik ein mächtiges Verfahren, um schwache Veränderungen in den Bakterienprofilen zu finden und Korrelationen hinsichtlich der Cholesterin- und Triglyceridkonzentration zwischen Bakterienpopulationen und Gesundheitsmarkern herzustellen. Unser Protokoll ist generisch und kann so verwendet werden, um andere Verbindungen oder Nährstoffe mit dem Potential zu untersuchen, das Wirtsmikro zu verändernRobiota Zusammensetzung, entweder beim Studium der Toxizität oder nützliche Auswirkungen.
Introduction
Bakteriocine sind antimikrobielle Peptide, die durch einen breiten Bereich von Bakterienarten 1 , 2 hergestellt werden . Diese Verbindungen und ihre Produzenten, insbesondere LAB, wurden seit Jahrzehnten weltweit für ihre Einsatzmöglichkeiten in der Lebensmittelkonservierung und Medizin erforscht und ausgenutzt 3 . Mehrere Bakteriocine sind bekannt, um wichtige Pathogene, einschließlich Arten von Listeria, Enterococcus, Staphylococcus und Bacillus zu töten. Einige Bakteriocine haben sogar die Fähigkeit, die Immunantwort zu modulieren 4 . Viele Bakteriocine haben relativ schmale Spektren, eine Eigenschaft, die in einigen Anwendungen sehr geschätzt wird. Zum Beispiel können einige schmalbandige Bakteriocine verwendet werden, um spezifische Aktivität gegen ausgewählte Gruppen von problematischen Bakterien zu lenken, ohne viel Störung auf die kommentare oder nützliche Flora, die dieselbe Nische teilt; Dies ist besonders wichtig im DarmumfeldWo zahlreiche nützliche Mikroben in einer interaktiven und dynamischen Weise gedeihen 5 . Bakteriocine sind auch für den prophylaktischen oder probiotischen Gebrauch sehr attraktiv, da sie das (Aus-) Wachstum von Pathogenen, Pathobionten oder opportunistischen Bakterien, die die Darmhomöostase 6 , 7 ausgleichen können, unterdrücken können.
In ihrer Natur und ihren physikochemischen Eigenschaften sind Bakteriocine sehr unterschiedlich, da sie unterschiedliche Strukturen, Zielspezifitäten, Wirkungsweisen usw. aufweisen. Die meisten Bakteriocine wurden in vitro- Einstellungen sehr genau untersucht, aber nur wenige wurden in Lebensmitteln getestet Matrizen 8 , 9 oder in vivo, wie in einem Tierdarm 6 , 10 . Die in vitro Eigenschaften können sich in hohem Maße unterscheiden, wenn sie in vivo aufgrund der Komplexität o bewertet werdenF die Darmumgebung und auch zu mutmaßlichen unbeabsichtigten Wirkungen auf nützliche Bakterien. Die meisten Probiotika sind LAB. Sie produzieren eine Reihe von anderen Metaboliten, einschließlich kurzkettiger Fettsäuren, von denen bekannt ist, dass sie die Physiologie des Wirts beeinflussen, sowie antimikrobielle Eigenschaften gegenüber bestimmten Bakterien zu demonstrieren. Daher ist es im Falle von probiotischen Stämmen, die Bakteriocine produzieren, am besten, um realistische Assays, wie gesunde Tiere mit normaler Mikrobiota, zu etablieren.
In der vorliegenden Studie stellen wir eine Strategie zur Verfügung, die die Beurteilung der Wirkung verschiedener Bakteriocin-produzierender Stämme ermöglicht, deren Bakteriocine bei gesunden Mäusen unterschiedliche Hemmungsspektren aufweisen. Unsere Strategie umfasst die Fütterung von Mäusen mit isogenen Nicht-Bakteriocin-Mutanten, die die Differenzierung von Bakteriocin-vermittelten Effekten aus Nicht-Bakteriocin-vermittelten Effekten ermöglichen. Sequenzierung 16S rDNA erlaubt es, die dynamischen Veränderungen der Bakterienpopulation im Darm zu verfolgen. SubsGleiche statistische Analyse entschlüsselt Korrelationen zwischen Bakterienarten und auch zwischen Bakterienarten und gemessenen physiologischen Parametern ( zB Körpergewicht, serumbiochemische Parameter usw. ). Wir glauben, dass das in dieser Studie vorgestellte Protokoll auch auf andere probiotische oder präbiotische Anwendungen anwendbar ist, die über die Untersuchung von Bakteriocinen in lebenden Tieren hinausgehen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Verfahren wurde verwendet, um festzustellen, ob Veränderungen in der Mikrobiota an Gesundheit oder Alter gebunden sind. Verschiedene Teile des Protokolls sind wichtig, aber unter ihnen werden die Fäkalien entnommen, das DNA-Fragment sequenziert und analysiert, und die Durchführung der DNA-Extraktion und der bioinformatischen Analyse könnten sicherlich die kritischsten Punkte sein. Das Sampling ist entscheidend, weil aus ethischen Gründen Mäuse nicht gestresst werden sollten und weil es bekann…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken der EEA Grant NILS Wissenschaft und Nachhaltigkeit Coordinated Mobility of Researchers (Referenz 017-ABEL-CM-2013). CB und GP-M. Wurden von der AGL2015-70487-P Stipendium des spanischen Ministeriums für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit unterstützt. OCOU und DBD wurden von einem strategischen Stipendienprogramm für die Lebensmittelwissenschaftliche Forschung von der Norwegischen Universität für Biowissenschaften (NMBU) (Projekt 1205051025) unterstützt. Wir danken auch Inmaculada Noguera für ihre Unterstützung bei Tierpflege und Probenahme und Jesus Dehesa für seine Hilfe bei der Gewährleistung der Verfügbarkeit von Labormaterialien in der Tierfazilität. Wir schätzen auch Professor Lars-Gustav Snipen für seinen Rat über die Statistik.
Materials
| Balb/c mice (female) | Harlan | Mice should be 6 – 8 weeks of age | |
| Plastic Petri dish | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| Brain-Heart-Infusion broth | Conda | 1400.00 | |
| European Bacteriological Agar | Pronadisa | 1800.00 | |
| Agarose D1 Low EEO | Pronadisa | 8010.00 | |
| 1XTAE buffer | Thermo Scientific | 15558042 | |
| MRS broth | Difco | 288130 | |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| scale | Mettler Toledo | PB602-S | |
| sterile forceps | Levantina de Laboratorios S.L. | 260-3710014 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Centrifuge | Hermle | Z383K | |
| sodium chloride | AppliChem Panreac | 121659.1211 | |
| Realpure SSS Kit | Real Life Science Solutions, Durviz, Spain | RBME04 (300 ml) | |
| Isopropanol | AppliChem Panreac | 131090.1611 | |
| Ethanol | AppliChem Panreac | 131086.1214 | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter Genomics, USA | A63881 (60 ml) | |
| PerfeCta NGS library quantification kit | Quanta BioSciences, Maryland, USA | 733-2300 | |
| MiSeq v3 reagent kit | Illumina, San Diego, California, USA | MS-102-3003 | |
| Primers for 16S rRNA gene amplification | Primers contain V3-V4 region of bacterial 16S rRNA gene and Illumina overhang adaptors:5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3’ and 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3’ | ||
| Nextera XT Index kit | FC-131-1002 | Indices and Illumina sequencing adaptors | |
| Micropestle for 1.5 ml tubes, Eppendorf / Sigma , Ref. | Sigma | Z317314-1PAK | |
| Glass beads, 0.1 mm diameter | Biospec Products | 11079-101 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609.25 | |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International Inc. | 19-040 | |
| mutanolysin | Sigma | M9901-10KU | |
| lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| proteinase K | Roche | 3115887001 | |
| Rnase A | Sigma | R4875 |
References
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