JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologie

Высокопроизводительного скрининга для наследования на основе белков в S. cerevisiae

Published: August 08, 2017
doi:
10.3791/56069
,
1Department of Developmental Biology,Stanford University School of Medicine, 2Department of Chemical and Systems Biology,Stanford University School of Medicine

Summary

Этот протокол описывает высок объём методологию функционально экран для наследования на основе белков в S. cerevisiae.

Abstract

Кодирование биологической информации, доступной для будущих поколений обычно достигается через изменения в последовательности ДНК. Долгоживущих наследования, закодированные в конформации белка (а не последовательность) долго рассматривалась как сдвиг парадигмы, но редко. Лучше всего характеризуется примеры таких эпигеномные элементов являются прионы, которые обладают самостоятельной сборки поведение, которое может управлять наследуемое проявление новых фенотипов. Многие архетипической прионов отображения ярких предвзятости последовательности N/Q-богатые и собрать в амилоида лоно. Эти необычные свойства сообщили большинство скрининг усилия по выявлению новых прионных белков. Однако по крайней мере три известных прионы, (в том числе основателей прионы, ОТРSc) не гавань этих биохимических характеристик. Поэтому мы разработали альтернативный метод прозондирует область на основе белков наследования на основе свойства массовых действий: переходных гиперэкспрессия прионных белков увеличивает частоту, на которой они приобретают конформации self шаблонов. Этот документ описывает метод для анализа дрожжей ORFeome способность добиться на основе белков наследования. Используя эту стратегию, мы ранее обнаружил, что > 1% белков, дрожжи могут топлива появление биологических черт, которые были долгоживущих, стабильной и возникают чаще, чем генетической мутации. Этот подход может быть использован в высокой пропускной способности через весь ORFeomes или как целенаправленного скрининга парадигмы для конкретных генетических сетей или экологических раздражителей. Так же, как вперед генетических экраны определяют многочисленные пути развития и сигнализации, эти методы обеспечивают методологию для исследовать влияние наследования на основе белков в биологических процессах.

Introduction

Биологические системы часто испытывают временные колебания в изобилии белка. Ли они имеют долговременное воздействие на формирование фенотип организма или будущих поколений остается неясным. Известных экземпляров этой биологии включать редкие класса белков, прионы, подталкивающих появление наследственные черты без модификации генома. Вместо этого эти проteinaceous и вобструктиным частицы передают фенотипов через самоподдерживающиеся изменения конформации белка1,2. Этот тип наследования был обнаружен в качестве причины необычной наследования шаблонов разрушительные нейродегенеративных заболеваний. Однако исследования в организмах, начиная от грибов до млекопитающих3,4,5,6,,78,9,10 с тех пор показали, что китовая птичка как элементы могут иметь значение adaptive. Тем не менее прионы были осмотрены как увлекательная, но редких биологических странность.

Этот сложившейся мудрость проводится в части потому что характеристика на основе белков наследования давно были ограничены небольшим набором примеров. Недавние усилия систематического отбора значительно расширили эту картину путем выявления несколько новых bona fide прионов11 и белка почти двух десятков доменов12 мощностью до конформационные конверсии топлива китовая птичка как. Однако потому что эти подходы как правило сосредоточены на сильных аминокислот последовательности предубеждения, прионы, которые были обнаружены поделиться биохимические свойства основателей дрожжи прионов [PSI+]13,14,15[URE3] и [RNQ+]11,16. К ним относятся: 1) Модульная домены, которые богаты длинные полимерные тянется аспарагин (N) и (Q), глютамин 2) Ассамблея в амилоида [китовая птичка+] конформации17,18,19и 3) завершить зависимость disaggregase функции Hsp104 для верных распространения от матери к дочери13,,2021. Действительно, многие bona fide прионы, включая [Гар+], [Het-s] и даже оригинальные китовая птичка (ScPrP), будет не хватать под такие строгие критерии. Возможно более важно, они будут не в состоянии захватить любых новых механизмов на основе белков наследования22. Таким образом истинный биологических ширина таких явлений может быть гораздо более общий характер, чем предполагалось ранее.

Расследовать этот вопрос, было занято высокой пропускной способностью, протеома общесистемной стратегии. Отличительной чертой всех прионы, включая PrPSc, [Гар+], и [Het-s], что переходные гиперэкспрессия причинной белков сильно увеличивает скорость прионных приобретение15,23,24,25,26. Мы воспользовались эта возможность систематически во всем дрожжей ORFeome, спросить, если стабильной основе белка, эпигенетических государств мог бы быть инициирован временно вызывая гиперэкспрессия индивидуальных белков. Это хорошо известно, что гиперэкспрессия белка может изменить фенотипов27. Однако прионных белков являются необычными, потому что их временные перепроизводства производит изменение фенотипа, что наследственные многие сотни поколений после первоначального гиперэкспрессия. Мы ранее принял преимущество этой функции, а также необычные наследования шаблонов на основе белков генетические элементы, чтобы определить десятки белков, которые способны heritably повторной проводки фенотипические пейзажи без изменения генома28. Хотя некоторые выявленные белков ранее были известны как прионы, большинство не было, подчеркнув сила этого подхода для выявления новых форм на основе белков наследования.

Protocol

1. Initial Overexpression Transform the yeast cells (in this case, BY4741 MAT a haploids) previously grown in YPD liquid (10 g of yeast extract, 20 g of peptone, and 20 g of glucose per 1 L) with the desired candidate constructs from the FLEXGene ORFeome library (yeast ORFs under the control of a galactose-inducible promoter in the URA3-marked centromericplasmid backbone, pBY01129). Use autoclaved toothpicks to pick four separate colonies from these…

Representative Results

Protein overexpression is known to dramatically alter cellular phenotypes27. Indeed, with an initial screening approach, hundreds of new phenotypes were reproducibly recovered from the overexpression of clones from the yeast ORFeome using just ten stressors. However, the assays described above allow for the assessment of whether cells retain any long-term stable phenotypes following this overexpression. One protein capable of encoding such a state is Psp1. Psp1 is …

Discussion

Первый прионов дрожжи были определены их необычные фенотипы и запутанной модели наследования. Характеристики этих прионы, затем были использованы для построения алгоритмов и вычислительных средств экран для дополнительных прионных белков. Метод, описанный здесь, напротив, экспериме?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Sohini Chakrabortee, Сандра Джонс, Дэвид Гарсия, Bhupinder Bhullar, Амелия Chang, Ричард она и Сьюзен Линдквист за их помощь в разработке анализов, используемые в этом документе, а также рецензентов для их вдумчивые комментарии.

Materials

Guanidine hydrochloride Sigma Cat#G3272-25G Chemical
Manganese chloride Sigma Cat#M8054-100G Chemical
Ethidium bromide Sigma E1510 Chemical
5-Fluoroorotic Acid Sigma Cat#F5013-50MG Chemical
BY4741 MATa (his3Δ1 leu2Δ0 LYS2 met15Δ0 ura3Δ0) Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 N/A Yeast strain
BY4741 MATα (his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 MET15 ura3Δ0) Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 N/A Yeast strain
Hsp70 (K69M)  Jarosz et al., 2014b N/A Plasmid
FLEXGene library Hu et al., 2007 N/A Plasmid library
Dextrose (glucose) Fisher Scientific D16-3 Media component
Raffinose Sigma R0250-25G Media component
Galactose Fisher Scientific BP656-500 Media component
CSM Sunrise Science 1001-100 Media component
CSM-URA Sunrise Science 1004-100 Media component
CSM-LYS Sunrise Science 1032-100 Media component
CSM-MET Sunrise Science 1019-100 Media component
CSM-LYS-MET Sunrise Science 1035-100 Media component
yeast extract Fisher Scientific BP1422-2 Media component
peptone Research Products International P20240-5000 Media component
bacto-peptone BD 211677 Media component
glycerol EMD Millipore GX0185-2 Media component
yeast nitrogen base w/o amino acids BD 291920 Media component
agar IBI Scientific IB49172 Media component
Adenine sulfate Sigma A3159-25G Media component
Potassium acetate Sigma P1190-500G Media component
Uracil Sigma U0750-100G Media component
Histidine Sigma H8000-100G Media component
Leucine Sigma L8000-25G Media component
Lysine Sigma L5501-25G Media component
RNase I  Thermo Fisher Scientific EN0601 Enzyme
biotinylated DNase Thermo Fisher Scientific AM1906 Enzyme
zymolyase 100T (yeast lytic enzyme) Sunrise Science N0766555 Enzyme
Microplate reader BioTek Synergy H1 Equipment
Microplate stacker BioTek BioStack3 Equipment
Plate filler BiotTek EL406 Equipment
Liquid handling robot Beckman Coulter Biomek FX Equipment
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Halfmann, R., Alberti, S., Lindquist, S. Prions, protein homeostasis, and phenotypic diversity. Trends Cell Biol. 20 (3), 125-133 (2010).
  2. Byers, J. S., Jarosz, D. F. Pernicious pathogens or expedient elements of inheritance: the significance of yeast prions. PLoS Pathog. 10 (4), 1003992 (2014).
  3. Jarosz, D. F., et al. Cross-kingdom chemical communication drives a heritable, mutually beneficial prion-based transformation of metabolism. Cell. 158 (5), 1083-1093 (2014).
  4. True, H. L., Lindquist, S. L. A yeast prion provides a mechanism for genetic variation and phenotypic diversity. Nature. 407 (6803), 477-483 (2000).
  5. Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress. Science. 336 (6079), 355-359 (2012).
  6. Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146 (3), 448-461 (2011).
  7. Cai, X., et al. Prion-like polymerization underlies signal transduction in antiviral immune defense and inflammasome activation. Cell. 156 (6), 1207-1222 (2014).
  8. Majumdar, A., et al. Critical role of amyloid-like oligomers of Drosophila Orb2 in the persistence of memory. Cell. 148 (3), 515-529 (2012).
  9. Khan, M. R., et al. Amyloidogenic Oligomerization Transforms Drosophila Orb2 from a Translation Repressor to an Activator. Cell. 163 (6), 1468-1483 (2015).
  10. Fioriti, L., et al. The Persistence of Hippocampal-Based Memory Requires Protein Synthesis Mediated by the Prion-like Protein CPEB3. Neuron. 86 (6), 1433-1448 (2015).
  11. Derkatch, I. L., Bradley, M. E., Hong, J. Y., Liebman, S. W. Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN(+)]. Cell. 106 (2), 171-182 (2001).
  12. Alberti, S., Halfmann, R., King, O., Kapila, A., Lindquist, S. A systematic survey identifies prions and illuminates sequence features of prionogenic proteins. Cell. 137 (1), 146-158 (2009).
  13. Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi+]. Science. 268 (5212), 880-884 (1995).
  14. Patino, M. M., Liu, J. J., Glover, J. R., Lindquist, S. Support for the prion hypothesis for inheritance of a phenotypic trait in yeast. Science. 273 (5275), 622-626 (1996).
  15. Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264 (5158), 566-569 (1994).
  16. Sondheimer, N., Lindquist, S. Rnq1: an epigenetic modifier of protein function in yeast. Mol Cell. 5 (1), 163-172 (2000).
  17. Balbirnie, M., Grothe, R., Eisenberg, D. S. An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2375-2380 (2001).
  18. Glover, J. R., et al. Self-seeded fibers formed by Sup35, the protein determinant of [PSI+], a heritable prion-like factor of S. cerevisiae. Cell. 89 (5), 811-819 (1997).
  19. King, C. Y., et al. Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (13), 6618-6622 (1997).
  20. Shorter, J., Lindquist, S. Hsp104 catalyzes formation and elimination of self-replicating Sup35 prion conformers. Science. 304 (5678), 1793-1797 (2004).
  21. Ferreira, P. C., Ness, F., Edwards, S. R., Cox, B. S., Tuite, M. F. The elimination of the yeast [PSI+] prion by guanidine hydrochloride is the result of Hsp104 inactivation. Mol Microbiol. 40 (6), 1357-1369 (2001).
  22. Caudron, F., Barral, Y. A super-assembly of Whi3 encodes memory of deceptive encounters by single cells during yeast courtship. Cell. 155 (6), 1244-1257 (2013).
  23. Wickner, R. B., Edskes, H. K., Shewmaker, F. How to find a prion: [URE3], [PSI+] and [beta]. Methods. 39 (1), 3-8 (2006).
  24. Chernoff, Y. O., Derkach, I. L., Inge-Vechtomov, S. G. Multicopy SUP35 gene induces de-novo appearance of psi-like factors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet. 24 (3), 268-270 (1993).
  25. Brown, J. C., Lindquist, S. A heritable switch in carbon source utilization driven by an unusual yeast prion. Genes Dev. 23 (19), 2320-2332 (2009).
  26. Coustou, V., Deleu, C., Saupe, S., Begueret, J. The protein product of the het-s heterokaryon incompatibility gene of the fungus Podospora anserina behaves as a prion analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (18), 9773-9778 (1997).
  27. Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Mol Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
  28. Chakrabortee, S., et al. Intrinsically Disordered Proteins Drive Emergence and Inheritance of Biological Traits. Cell. 167 (2), 369-381 (2016).
  29. Hu, Y., et al. Approaching a complete repository of sequence-verified protein-encoding clones for Saccharomyces cerevisiae. Genome Res. 17 (4), 536-543 (2007).
  30. Swain, P. S., et al. Inferring time derivatives including cell growth rates using Gaussian processes. Nat Commun. 7, 13766 (2016).
  31. Jarosz, D. F., Lancaster, A. K., Brown, J. C., Lindquist, S. An evolutionarily conserved prion-like element converts wild fungi from metabolic specialists to generalists. Cell. 158 (5), 1072-1082 (2014).
  32. Neiman, A. M. Sporulation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Génétique. 189 (3), 737-765 (2011).
  33. Gietz, D., St Jean, A., Woods, R. A., Schiestl, R. H. Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. Nucleic Acids Res. 20 (6), 1425 (1992).
  34. Formosa, T., Nittis, T. Suppressors of the temperature sensitivity of DNA polymerase alpha mutations in Saccharomyces cerevisiae. Mol Gen Genet. 257 (4), 461-468 (1998).
  35. Christiano, R., Nagaraj, N., Frohlich, F., Walther, T. C. Global proteome turnover analyses of the Yeasts S. cerevisiae and S. pombe. Cell Rep. 9 (5), 1959-1965 (2014).
  36. Lancaster, A. K., Nutter-Upham, A., Lindquist, S., King, O. D. PLAAC: a web and command-line application to identify proteins with prion-like amino acid composition. Bioinformatics. 30 (17), 2501-2502 (2014).
  37. Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. (17), (2008).
  38. Rogoza, T., et al. Non-Mendelian determinant [ISP+] in yeast is a nuclear-residing prion form of the global transcriptional regulator Sfp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10573-10577 (2010).
  39. Shorter, J., Lindquist, S. Prions as adaptive conduits of memory and inheritance. Nat Rev Genet. 6 (6), 435-450 (2005).
  40. Tanaka, M., Chien, P., Naber, N., Cooke, R., Weissman, J. S. Conformational variations in an infectious protein determine prion strain differences. Nature. 428 (6980), 323-328 (2004).
  41. Tanaka, M., Weissman, J. S. An efficient protein transformation protocol for introducing prions into yeast. Methods Enzymol. 412, 185-200 (2006).
  42. Roberts, B. T., Wickner, R. B. Heritable activity: a prion that propagates by covalent autoactivation. Genes Dev. 17 (17), 2083-2087 (2003).
  43. Ozbudak, E. M., Thattai, M., Lim, H. N., Shraiman, B. I., Van Oudenaarden, A. Multistability in the lactose utilization network of Escherichia coli. Nature. 427 (6976), 737-740 (2004).

Tags

High-throughput ScreeningProtein-based InheritanceS. CerevisiaePrionProtein Over-expressionPhenotypic Memory96-well Plate384-well PlateLiquid Handling RobotOptical DensityManganese ChlorideSD-URASCal-URAST-URA
check_url/fr/56069?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Byers, J. S., Jarosz, D. F. High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae. J. Vis. Exp. (126), e56069, doi:10.3791/56069 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image