Этот протокол описывает высок объём методологию функционально экран для наследования на основе белков в S. cerevisiae.
Кодирование биологической информации, доступной для будущих поколений обычно достигается через изменения в последовательности ДНК. Долгоживущих наследования, закодированные в конформации белка (а не последовательность) долго рассматривалась как сдвиг парадигмы, но редко. Лучше всего характеризуется примеры таких эпигеномные элементов являются прионы, которые обладают самостоятельной сборки поведение, которое может управлять наследуемое проявление новых фенотипов. Многие архетипической прионов отображения ярких предвзятости последовательности N/Q-богатые и собрать в амилоида лоно. Эти необычные свойства сообщили большинство скрининг усилия по выявлению новых прионных белков. Однако по крайней мере три известных прионы, (в том числе основателей прионы, ОТРSc) не гавань этих биохимических характеристик. Поэтому мы разработали альтернативный метод прозондирует область на основе белков наследования на основе свойства массовых действий: переходных гиперэкспрессия прионных белков увеличивает частоту, на которой они приобретают конформации self шаблонов. Этот документ описывает метод для анализа дрожжей ORFeome способность добиться на основе белков наследования. Используя эту стратегию, мы ранее обнаружил, что > 1% белков, дрожжи могут топлива появление биологических черт, которые были долгоживущих, стабильной и возникают чаще, чем генетической мутации. Этот подход может быть использован в высокой пропускной способности через весь ORFeomes или как целенаправленного скрининга парадигмы для конкретных генетических сетей или экологических раздражителей. Так же, как вперед генетических экраны определяют многочисленные пути развития и сигнализации, эти методы обеспечивают методологию для исследовать влияние наследования на основе белков в биологических процессах.
Биологические системы часто испытывают временные колебания в изобилии белка. Ли они имеют долговременное воздействие на формирование фенотип организма или будущих поколений остается неясным. Известных экземпляров этой биологии включать редкие класса белков, прионы, подталкивающих появление наследственные черты без модификации генома. Вместо этого эти проteinaceous и вобструктиным частицы передают фенотипов через самоподдерживающиеся изменения конформации белка1,2. Этот тип наследования был обнаружен в качестве причины необычной наследования шаблонов разрушительные нейродегенеративных заболеваний. Однако исследования в организмах, начиная от грибов до млекопитающих3,4,5,6,,78,9,10 с тех пор показали, что китовая птичка как элементы могут иметь значение adaptive. Тем не менее прионы были осмотрены как увлекательная, но редких биологических странность.
Этот сложившейся мудрость проводится в части потому что характеристика на основе белков наследования давно были ограничены небольшим набором примеров. Недавние усилия систематического отбора значительно расширили эту картину путем выявления несколько новых bona fide прионов11 и белка почти двух десятков доменов12 мощностью до конформационные конверсии топлива китовая птичка как. Однако потому что эти подходы как правило сосредоточены на сильных аминокислот последовательности предубеждения, прионы, которые были обнаружены поделиться биохимические свойства основателей дрожжи прионов [PSI+]13,14,15[URE3] и [RNQ+]11,16. К ним относятся: 1) Модульная домены, которые богаты длинные полимерные тянется аспарагин (N) и (Q), глютамин 2) Ассамблея в амилоида [китовая птичка+] конформации17,18,19и 3) завершить зависимость disaggregase функции Hsp104 для верных распространения от матери к дочери13,,2021. Действительно, многие bona fide прионы, включая [Гар+], [Het-s] и даже оригинальные китовая птичка (ScPrP), будет не хватать под такие строгие критерии. Возможно более важно, они будут не в состоянии захватить любых новых механизмов на основе белков наследования22. Таким образом истинный биологических ширина таких явлений может быть гораздо более общий характер, чем предполагалось ранее.
Расследовать этот вопрос, было занято высокой пропускной способностью, протеома общесистемной стратегии. Отличительной чертой всех прионы, включая PrPSc, [Гар+], и [Het-s], что переходные гиперэкспрессия причинной белков сильно увеличивает скорость прионных приобретение15,23,24,25,26. Мы воспользовались эта возможность систематически во всем дрожжей ORFeome, спросить, если стабильной основе белка, эпигенетических государств мог бы быть инициирован временно вызывая гиперэкспрессия индивидуальных белков. Это хорошо известно, что гиперэкспрессия белка может изменить фенотипов27. Однако прионных белков являются необычными, потому что их временные перепроизводства производит изменение фенотипа, что наследственные многие сотни поколений после первоначального гиперэкспрессия. Мы ранее принял преимущество этой функции, а также необычные наследования шаблонов на основе белков генетические элементы, чтобы определить десятки белков, которые способны heritably повторной проводки фенотипические пейзажи без изменения генома28. Хотя некоторые выявленные белков ранее были известны как прионы, большинство не было, подчеркнув сила этого подхода для выявления новых форм на основе белков наследования.
Первый прионов дрожжи были определены их необычные фенотипы и запутанной модели наследования. Характеристики этих прионы, затем были использованы для построения алгоритмов и вычислительных средств экран для дополнительных прионных белков. Метод, описанный здесь, напротив, экспериме?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Sohini Chakrabortee, Сандра Джонс, Дэвид Гарсия, Bhupinder Bhullar, Амелия Chang, Ричард она и Сьюзен Линдквист за их помощь в разработке анализов, используемые в этом документе, а также рецензентов для их вдумчивые комментарии.
Guanidine hydrochloride | Sigma | Cat#G3272-25G | Chemical |
Manganese chloride | Sigma | Cat#M8054-100G | Chemical |
Ethidium bromide | Sigma | E1510 | Chemical |
5-Fluoroorotic Acid | Sigma | Cat#F5013-50MG | Chemical |
BY4741 MATa (his3Δ1 leu2Δ0 LYS2 met15Δ0 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
BY4741 MATα (his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 MET15 ura3Δ0) | Winston et al., 1995; Brachmann et al., 1998 | N/A | Yeast strain |
Hsp70 (K69M) | Jarosz et al., 2014b | N/A | Plasmid |
FLEXGene library | Hu et al., 2007 | N/A | Plasmid library |
Dextrose (glucose) | Fisher Scientific | D16-3 | Media component |
Raffinose | Sigma | R0250-25G | Media component |
Galactose | Fisher Scientific | BP656-500 | Media component |
CSM | Sunrise Science | 1001-100 | Media component |
CSM-URA | Sunrise Science | 1004-100 | Media component |
CSM-LYS | Sunrise Science | 1032-100 | Media component |
CSM-MET | Sunrise Science | 1019-100 | Media component |
CSM-LYS-MET | Sunrise Science | 1035-100 | Media component |
yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Media component |
peptone | Research Products International | P20240-5000 | Media component |
bacto-peptone | BD | 211677 | Media component |
glycerol | EMD Millipore | GX0185-2 | Media component |
yeast nitrogen base w/o amino acids | BD | 291920 | Media component |
agar | IBI Scientific | IB49172 | Media component |
Adenine sulfate | Sigma | A3159-25G | Media component |
Potassium acetate | Sigma | P1190-500G | Media component |
Uracil | Sigma | U0750-100G | Media component |
Histidine | Sigma | H8000-100G | Media component |
Leucine | Sigma | L8000-25G | Media component |
Lysine | Sigma | L5501-25G | Media component |
RNase I | Thermo Fisher Scientific | EN0601 | Enzyme |
biotinylated DNase | Thermo Fisher Scientific | AM1906 | Enzyme |
zymolyase 100T (yeast lytic enzyme) | Sunrise Science | N0766555 | Enzyme |
Microplate reader | BioTek | Synergy H1 | Equipment |
Microplate stacker | BioTek | BioStack3 | Equipment |
Plate filler | BiotTek | EL406 | Equipment |
Liquid handling robot | Beckman Coulter | Biomek FX | Equipment |