In Vitro Caratterizzazione delle proprietà elettrofisiologiche di fibre afferenti coliche in ratti
Summary
Anormale funzione sensoriale è alla base di dolore viscerale e altri sintomi delle malattie intestinali infiammatorie e funzionali. Un protocollo per la registrazione elettrofisiologica dei nervi afferenti colici in una preparazione di colorectum del ratto ex vivo è presentato qui.
Abstract
Disfunzione dei nervi sensoriali colici è stata implicata in patofisiologia di parecchi termini comuni, compreso il diabete e le malattie intestinali infiammatorie e funzionali. Qui, descriviamo un protocollo per la caratterizzazione in vitro delle proprietà elettrofisiologiche delle afferenze colica in ratti. Colorectum, con il ganglio pelvico intatto (PG) collegato, viene rimosso dal ratto; superfusi con carbogenated soluzione di Krebs nella camera di registrazione; e cannulate alle estremità orale e anale per consentire per distensione. Un fascio di nervi bene che emana dal PG viene identificato, e l’attività nervose afferenti multiunit viene registrata utilizzando un elettrodo di aspirazione. Distensione del segmento colico suscita aumenti graduali in scarico multiunit. Un’analisi delle componenti principali è condotto per distinguere la bassa soglia, l’alto-soglia e le fibre afferenti del largo-gamma dinamica. Sensibilità chimica delle afferenze colica può essere studiata attraverso la vasca o intraluminal somministrazione di sostanze da testare. Questo protocollo può essere modificato per applicazione ad altre specie, come topi e porcellini d’India e di studiare le differenze nelle proprietà elettrofisiologiche delle afferenze toracolombare/hypogastric e lombosacrale/pelvica del colon discendente in normale e condizioni patologiche.
Introduction
Tratto gastrointestinale (GIT) è riccamente innervato con estrinseci nervi afferenti che trasmettono segnali sensoriali dall’intestino al sistema nervoso centrale e che contribuiscono all’interazione di intestino-cervello. Alterata eccitabilità di queste afferenze estrinseca, come pure alterata elaborazione centrale degli input afferente, è alla base di dolore viscerale e altri sintomi di GI condizioni, tra cui funzionali e infiammatorie intestinali malattie1. Informazioni sensoriali da colorectum viene trasmesso principalmente attraverso il toracolombare/hypogastric e i nervi lombosacrale/pelvici (PN)2. C’è stato un crescente interesse nello studiare le proprietà elettrofisiologiche di queste fibre afferenti primarie nei modelli del roditore del morbo. Tuttavia, in vivo le registrazioni elettrofisiologiche delle afferenze colica nei roditori è una sfida tecnica e richiede una notevole abilità chirurgica. Inoltre, i cambiamenti emodinamici, il movimento del tessuto e anestetici possono incidere anche l’attività del nervo e la sensibilità per testare gli stimoli in vivo. Di conseguenza, negli ultimi anni, un numero crescente di studi è impiegate preparazioni in vitro (ex vivo) di specie diverse, tra cui topi, ratti, cavie e gli esseri umani, di esaminare i meccanismi di trasduzione sensoriale a Colico afferenze e l’eccitabilità alterata in condizioni di malattia. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8
Due tipi di ex vivo preparazione colica principalmente sono stati segnalati: il “piatto-foglio” preparazione5,9,10 e il “tubo” preparazione3,4. Un video protocollo per la preparazione di colorectum murino “piatto-foglio” è stato pubblicato in precedenza11. In questo protocollo, colorectum del mouse, con il PN) o Nervi Splancnici lombari (LSN) collegati, è raccolto e superfusi in una camera di tessuto. Colorectum è tagliati longitudinalmente, e il pacco del nervo viene esteso in un vano di registrazione riempito con olio di paraffina. L’attività del nervo viene registrata utilizzando un elettrodo di platino-iridio monopolare. Il protocollo consente l’identificazione dei campi ricettivi di singole fibre afferenti tramite stimolazione elettrica imparziale. Localizza l’applicazione di stimoli chimici, così come l’applicazione di paradigmi diversi stimoli meccanici (ad es., focale della mucosa sondaggio e tratto della circonferenza), per le terminazioni nervose afferenti. Poiché il nervo deve essere estesa a una camera separata dalla camera del tessuto, è fondamentale per mantenere il nervo collegato relativamente lungo; la dissezione successo dei nervi rappresenta una sfida per quelli nuovi a questa metodologia. Più recentemente, Nullens et al pubblicato un video di protocollo per la registrazione in vitro delle afferenze mesenterica murino digiunale e segmenti colici12. In questa preparazione di “tubo”, il segmento di intestino con il mesentere attaccato è mantenuto intatto, consentendo in tal modo graduale distensione e la somministrazione intra – ed extra-luminale di diverse sostanze chimiche. Poiché il nervo mesentere viene registrato utilizzando un elettrodo di aspirazione, che può essere posizionato in prossimità del tessuto, attività afferente possono essere registrati anche se il nervo mesentere è relativamente breve. Tuttavia, il nervo di mesentere costituito da popolazioni miste di fibre afferenti vagali e spinali che innervano il digiuno o toracolombare hypogastric. Afferenze pelvici lombosacrale innervano colorectum, che non possono essere discriminati in questo protocollo. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la registrazione elettrofisiologica delle afferenze colica ratto usando la preparazione del colon-retto “a tubo” con un PG intatto. Questo metodo potrebbe consentire per la caratterizzazione delle proprietà funzionali di lombare splancnico (hypogastric) e lombosacrale pelvico afferenze.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo presentato qui è un metodo relativamente semplice sperimentale per valutare le proprietà elettrofisiologiche delle afferenze colica dei ratti. Il protocollo (da dissezione del tessuto per impostare la registrazione del nervo) di solito ci vogliono circa 2 ore per completare. Raccolta di tessuto (passaggio 3) e la preparazione dell’elettrodo aspirazione (passo 5) sono i punti critici. È fondamentale essere in grado di individuare il PG, il numero LSN e il PN e fare attenzione a non per danneggiare il gang…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo protocollo è stato sostenuto da borse di ricerca da National Foundation Natural Science of China (#31171066, #81270464) e il centro di scienza di Sino-tedesco (GZ919).
Materials
| Sodium Pentobarbital | Shanghai Westang Bio-Tech | B558 | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | |
| Electrode puller | MicroData Instrument Inc | PMP107 | |
| Neurolog System (Bioamplifier) | Digitimer, Ltd | Neurolog System | |
| A/D converter | Cambridge Electronic Design | Micro1401 | |
| Data processing software | Cambridge Electronic Design | Spike2 version 6 | |
| Silver wire | World Precision Instruments | EP12 | |
| Glass tubes | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
| Electrode holder | World Precision Instruments | MEH3SBW | |
| Heating bath | Grant | GR150 | |
| Dissecting microscope | Leica | Zoom2000 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments | PZMIII-BS | |
| Cigarette lighter | any | NA | |
| Surgical tools | World Precision Instruments | NA | |
| Insect pins | home-made from 0.1 mm stainless steel wire | NA | |
| Three way manipulator | World Precision Instruments | KITF-R | |
| Rats | Any | NA | Any strain/sex can be used. |
References
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