In Vitro Karakterisering av elektrofysiologiske egenskaper av Colonic afferente fibrene i rotter
Summary
Unormal sensoriske funksjonen ligger under visceral smerter og andre symptomer av funksjonelle og inflammatorisk tarm sykdommer. En protokoll for elektrofysiologiske innspillingen av colonic afferente nerver i en ex vivo rotte colorectum-forberedelse er presentert her.
Abstract
Dysfunksjon av colonic sensoriske nerver har vært innblandet i Patofysiologien ved flere vanlige betingelser, inkludert funksjonelle og inflammatorisk tarm sykdommer og diabetes. Her beskriver vi en protokoll for i vitro karakterisering av elektrofysiologiske egenskapene colonic afferente i rotter. Colorectum, med det intakt bekken ganglion (PG) knyttet, fjernes fra rotta; superfused med carbogenated Krebs løsning i innspillingen kammeret; og cannulated i muntlig og anal endene å tillate distensjon. En fin nerve bunt kommer fra PG er identifisert, og multiunit afferente nerve aktiviteten er registrert ved hjelp av et inntaks elektroden. Distensjon av colonic segmentet utløser gradvis økning i multiunit utslipp. En viktigste komponenten analyse er gjennomført for å skille lavterskeltilbud, høy-terskelen og bred drivkraft omfang afferente fibrene. Kjemisk sensitivitet colonic afferente kan studeres gjennom badekar eller intraluminal administrasjonen av testen forbindelser. Denne protokollen kan endres for andre arter, som mus og marsvin, og å studere forskjeller i egenskapene elektrofysiologiske thoracolumbar/hypogastric og lumbosacral/bekken afferente i synkende tykktarmen i normal bruk og patologiske forhold.
Introduction
Fordøyelsessystemet (GIT) er rikt innerveres med ytre afferente nerver som formidle sensoriske signaler fra tarmen til sentralnervesystemet og som bidrar til gut-hjerne samhandling. Endret excitability av disse ytre afferente og endret sentral behandling av afferente innganger, ligger under visceral smerter og andre symptomer på GI betingelser, inkludert funksjonelle og inflammatorisk tarm sykdommer1. Sensoriske informasjonen fra colorectum formidles primært gjennom den thoracolumbar/hypogastric og lumbosacral/bekken nerver (PN)2. Det har vært en økt interesse i å studere elektrofysiologiske egenskapene til disse primære afferente fibrene i gnager sykdom modeller. Men i vivo elektrofysiologiske opptak colonic afferente i gnagere er en teknisk utfordring og krever betydelig kirurgiske ferdigheter. I tillegg kan hemodynamic endringer, vev bevegelse og bedøvelse også påvirke nerve aktivitet og følsomheten å teste stimuli i vivo. Derfor de siste årene, har et økende antall studier ansatt i vitro (ex vivo) forberedelser av ulike arter, inkludert mus, rotter, marsvin og mennesker, å undersøke mekanismer for sensorisk signaltransduksjon i colonic afferente og endret excitability under sykdom forhold. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8
To typer ex vivo colonic forberedelse primært er rapportert: “flat ark” forberedelse5,9,10 og “rør” forberedelse3,4. En video protokoll “flat ark” murine colorectum forberedelse er tidligere utgitt11. I denne protokollen, mus-colorectum, med PN) eller lumbal splanchnic nerver (LSN) knyttet, er høstet og superfused i en vev kammer. Colorectum er kuttet åpne langs og nerve bunt er utvidet til et opptak rom fylt med parafinolje. Nerve aktivitet registreres ved hjelp av en monopolar platina-iridium elektrode. Protokollen tillater identifikasjon av feltene mottakelig for individuelle afferente fiber ved hjelp av upartiske elektrisk stimulering. Det regionaliserer bruk av kjemiske stimuli og anvendelse av ulike mekanisk stimulering paradigmer (f.eks fokal mucosal undersøkelser og omkrets strekk), til afferente nerve avslutninger. Fordi nerve utvides til en separat kammer fra vev kammer, er det avgjørende å holde vedlagte nerve relativt lang; den vellykkede Disseksjon av nerver utgjør en utfordring for de ny til denne metodikken. Flere nylig, Nullens et al. publisert en video protokoll for in vitro -opptak hvem afferente i murine jejunal og colonic segmenter12. I denne “rør” forberedelse holdes gut segmentet med mesentery knyttet intakt, slik at for gradert distensjon og intra – og ekstra-luminal administrasjonen av ulike kjemikalier. Siden mesentery nerve er registrert ved hjelp av et inntaks elektrode, som kan plasseres nær vevet, kan afferente aktivitet registreres selv om mesentery nerve er relativt kort. Men mesentery nerve består av blandet bestander av vagal og spinal afferente fibre som innervate jejunum eller thoracolumbar hypogastric. Lumbosacral bekken afferente innervate colorectum, som ikke kan bli diskriminert i denne protokollen. Her presenterer vi en detaljert protokoll for elektrofysiologiske innspillingen rotte colonic afferente “rør” colorectum utarbeidelse med en intakt PG. Denne metoden kan for karakterisering av funksjonelle egenskaper lumbale splanchnic (hypogastric) og lumbosacral bekken afferente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen presenteres her er relativt enkelt eksperimentell metode for å vurdere elektrofysiologiske egenskapene colonic afferente rotter. Protokollen (fra vev disseksjon oppsett nerve innspillingen) tar vanligvis ca 2 timer å fullføre. Vev samling (trinn 3) og utarbeidelse av inntaks elektroden (trinn 5) er viktige skritt. Det er viktig å kunne finne PG, LSN og PN og ta vare ikke for å skade ganglion og nervene under vev disseksjon. Spissen av glass pipette må være brutt og skrå til en størrelse som er kompat…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne protokollen ble støttet av forskningsmidler fra National Natural Science Foundation av Kina (#31171066, #81270464) og Sino-tysk Science Center (GZ919).
Materials
| Sodium Pentobarbital | Shanghai Westang Bio-Tech | B558 | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | |
| Electrode puller | MicroData Instrument Inc | PMP107 | |
| Neurolog System (Bioamplifier) | Digitimer, Ltd | Neurolog System | |
| A/D converter | Cambridge Electronic Design | Micro1401 | |
| Data processing software | Cambridge Electronic Design | Spike2 version 6 | |
| Silver wire | World Precision Instruments | EP12 | |
| Glass tubes | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
| Electrode holder | World Precision Instruments | MEH3SBW | |
| Heating bath | Grant | GR150 | |
| Dissecting microscope | Leica | Zoom2000 | |
| Dissecting microscope | World Precision Instruments | PZMIII-BS | |
| Cigarette lighter | any | NA | |
| Surgical tools | World Precision Instruments | NA | |
| Insect pins | home-made from 0.1 mm stainless steel wire | NA | |
| Three way manipulator | World Precision Instruments | KITF-R | |
| Rats | Any | NA | Any strain/sex can be used. |
References
- Al-Chaer, E. D., Traub, R. J. Biological basis of visceral pain: recent developments. Pain. 96 (3), 221-225 (2002).
- Christianson, J. A., Traub, R. J., Davis, B. M. Differences in spinal distribution and neurochemical phenotype of colonic afferents in mouse and rat. J Comp Neurol. 494 (2), 246-259 (2006).
- Wynn, G., Rong, W., Xiang, Z., Burnstock, G. Purinergic mechanisms contribute to mechanosensory transduction in the rat colorectum. Gastroenterology. 125 (5), 1398-1409 (2003).
- Dong, L., et al. Impairments of the Primary Afferent Nerves in a Rat Model of Diabetic Visceral Hyposensitivity. Mol Pain. 11, (2016).
- Lynn, P. A., Blackshaw, L. A. In vitro recordings of afferent fibres with receptive fields in the serosa, muscle and mucosa of rat colon. J Physiol. 518 (Pt 1), 271-282 (1999).
- Page, A. J., et al. Different contributions of ASIC channels 1a, 2, and 3 in gastrointestinal mechanosensory function. Gut. 54 (10), 1408-1415 (2005).
- Hockley, J. R., et al. P2Y Receptors Sensitize Mouse and Human Colonic Nociceptors. J Neurosci. 36 (8), 2364-2376 (2016).
- Peiris, M., et al. Human visceral afferent recordings: preliminary report. Gut. 60 (2), 204-208 (2011).
- Feng, B., Gebhart, G. F. Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (1), G170-G180 (2011).
- Feng, B., et al. Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents. J Neurosci. 33 (23), 9831-9839 (2013).
- Feng, B., Gebhart, G. F. In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings. J Vis Exp. (95), e52310 (2015).
- Nullens, S., et al. In Vitro Recording of Mesenteric Afferent Nerve Activity in Mouse Jejunal and Colonic Segments. J Vis Exp. (116), (2016).
- Rong, W., Hillsley, K., Davis, J. B., Hicks, G., Winchester, W. J., Grundy, D. Jejunalafferent nerve sensitivity in wild-type and TRPV1 knockout mice. J Physiol. 560 (Pt 3), 867-881 (2004).
- Brierley, S. M., et al. Differential chemosensory function and receptor expression of splanchnic and pelvic colonic afferents in mice). J Physiol. 567 (Pt 1), 267-281 (2005).
- Brierley, S. M., Jones, R. C. 3. r. d., Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127 (1), 166-178 (2004).
- La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Differences in the expression of transient receptor potential channel V1, transient receptor potential channel A1 and mechanosensitive two pore-domain K+ channels between the lumbar splanchnic and pelvic nerve innervations of mouse urinary bladder and colon. Neurosciences. 186, 179-187 (2001).
- Wang, G., Tang, B., Traub, R. J. Differential processing of noxious colonic input by thoracolumbar and lumbosacral dorsal horn neurons in the rat. J Neurophysiol. 94 (6), 3788-3794 (2005).
