Coltura In Vivo-piace murini astrociti utilizzando il protocollo AWESAM veloce, semplice e poco costoso
Summary
Il protocollo AWESAM descritto qui è ottimo per la coltura di astrociti murini in isolamento da altre cellule del cervello in modo veloce, semplice ed economica. Gli astrociti AWESAM esibiscono spontanea Ca2 + segnalazione, morfologia e gene expression profili simili a astrociti in vivo.
Abstract
Il AWESAM (un low-costo easy stellate unstrocyte metodo) protocollo comporta un modo veloce, semplice e poco costoso per generare grandi quantità di in vivo-piace monocolture di astrociti di topo e di ratto : Le cellule cerebrali possono essere isolate da diverse regioni del cervello, e dopo una settimana di coltura delle cellule, cellule non-astrocytic sono scrollate di dosso inserendo i piatti di cultura su un agitatore per 6 h nell’incubatrice. Gli astrociti rimanenti sono quindi attraversati in nuove piastre con un mezzo di Astrocita-specifici (chiamato NB + H). NB + H contiene basse concentrazioni di eparina-legante EGF-like growth factor (HBEGF), che viene utilizzato al posto del siero in mezzo. Dopo essere cresciuto in NB + H, gli astrociti AWESAM hanno una morfologia stellare e processi impercettibili e funzionalità. Inoltre, questi astrociti hanno più in vivo-come l’espressione genica di astrociti generati dai metodi precedentemente pubblicati. CA2 + imaging, dinamiche della vescicola e altri eventi vicino la membrana possono essere studiati così nello bene processi astrocytic in vitro, ad esempio, utilizzando cellule vive confocale o microscopia TIRF. In particolare, gli astrociti AWESAM inoltre esibiscono spontanea Ca2 + segnalazione simile a astrociti in vivo.
Introduction
Astrociti influenzano la funzione del cervello attraverso supporto trofico, flusso sanguigno, segnalazione sinaptica e plasticità e comunicazione intercellulare – che sono tutti meccanismi che centro attorno i processi astrocitari sottili. Il protocollo AWESAM descritto qui permette lo studio di questi processi senza interferenze da parte di neuroni e glia altri, che è utile per esempio, perché l’espressione di molte proteine e anche di Ca2 + segnalazione si sovrappongono in tutto cellula cerebrale diversa tipi. Inoltre, questo metodo supera i limiti delle tecniche precedentemente disponibili. In particolare, il nostro protocollo prevede in vivo-come morfologia (astrociti stellari con sottili processi) e l’espressione genica in un veloce, facile e modo a buon mercato.
Morfologia delle cellule, espressione genica e molti altri processi normativi sono direttamente influenzati dall’ambiente. In una piastra di coltura, si riferisce a fattori rilasciati dalle cellule circostanti, ma anche il mezzo in cui le cellule sono cresciute. Per gli astrociti, HBEGF precedentemente è stata segnalata per indurre una morfologia stellari1 ma è stato anche trovato per-differenziare gli astrociti2. Tuttavia, concentrazioni più basse di HBEGF più successivamente sono state utilizzate per la generazione di più nel vivo-come astrociti come identificato tramite sequenziamento di RNA in due differenti protocolli3,4. Inoltre, la morfologia del astrocyte cambia con la composizione media, indipendentemente dal protocollo4: Neurobasal medio con una bassa concentrazione di HBEGF è ottima per la coltivazione di astrociti stellari, mentre altre composizioni medie (ad es., contenenti siero DMEM) produrre cellule poligonali (anche negli astrociti appena isolati di immunopanning).
Il protocollo AWESAM sormonta gli svantaggi delle precedenti tecniche per la coltivazione del astrocyte monocolture4. Tecniche precedenti per la coltivazione di monocolture Astrocita presentano i seguenti svantaggi: morfologia poligonale, che è inconsueta che gli astrociti stellari in vivo (MD metodo)5; la lunghezza e il costo del protocollo (preparazione astrociti da prende le cellule staminali pluripotenti indotte tre mesi e richiede molti reagenti, compresi costosi fattori di crescita)6; la bassa quantità di materiale (metodo immunopanning)3; e la de-differenziazione degli astrociti e requisito di una matrice 3D (Puschmann et al.) 1 , 2. al contrario, fornisce il protocollo AWESAM: in vivo-come la morfologia (astrociti stellari con sottili processi); un veloce, facile e a buon mercato metodo; grandi quantità di materiale; e di più nel vivo-come espressione genica rispetto a immunopanned e astrociti di MD. Inoltre, cultura 2D consente lo studio di segnalazione di Ca2 + e riciclaggio in sottili processi e in eventi vicino la membrana della vescicola (ad es., microscopia TIRF non è possibile in 3D culture).
Il metodo di MD è stato ampiamente utilizzato dalla sua pubblicazione nel 19805, che offre una tecnica semplice e veloce per monocolture Astrocita poligonale. In breve, il metodo di MD comporta crescita cellule cerebrali misto nel siero fetale di vitello (FCS)-contenente DMEM, seguita da agitazione passaggi che arricchiscono per gli astrociti (come tutte le altre cellule di cervello tipi staccano dal piatto) e ulteriormente cultura sullo stesso supporto. DMEM completate con FCS è utilizzato per molti altri tipi di cellule, che vanno dai fibroblasti e adipociti a linee cellulari tumorali differenti, tutti condividono la morfologia poligonale esibita da astrociti MD nella cultura. Fino al primi anni 20007, piccolo pensiero era stato rilasciato ai media su misura per gli astrociti, in particolare per favorire la loro tipica morfologia stellare trovato in vivo. Un protocollo pubblicato nel 2011 raggiungere tale morfologia stellare: chiamato il metodo immunopanning, impiega medium senza siero, ottimizzato per la coltura di astrociti3. Utilizzando questo metodo, le cellule cerebrali di recente isolate sono esposti a una serie di piatti rivestiti con anticorpi destinati a proteine di superficie delle cellule di tipo-specific cella, per arricchire per gli astrociti. Nonostante il più in vivo-come profilo di morfologia ed espressione dei astrocytes immunopanned, la maggior parte degli studi in vitro si basa ancora sul metodo Astrocita MD. Il metodo di MD è semplice e veloce, mentre il metodo di immunopanning comprende più lunghe e complesse fasi il primo giorno della cultura (ad esempio lunghi periodi di digestione degli enzimi, attenta stratificazione delle soluzioni di diversa densità, immunopanning stesso, e diversi centrifugazione passi – tutto prima di placcatura). Tuttavia, utilizzando il mezzo più specializzato, il metodo AWESAM offre sia la velocità del metodo MD e lo in vivo-come la morfologia del protocollo immunopanning.
Nel complesso, il protocollo AWESAM è utile per studiare più in vivo-come astrociti in 2D monocolture isolate da neuroni e glia altri (come precedentemente caratterizzati4 immunostainings, immunoblots e sequenziamento di RNA). Esso consente lo studio dei processi astrocitari sottili e fornisce grande accessibilità per la visualizzazione di Ca2 + segnalazione spontanea ed eventi vicino la membrana (ad es., ripreso da microscopia TIRF).
Protocol
Representative Results
Discussion
Quattro passi all’interno del protocollo sono fondamentali: 1) preparare la concentrazione di HBEGF e precisamente 5 ng/mL, poiché piccoli aumenti nella concentrazione possono condurre a culture immature, ad esempio, 10 ng/mL HBEGF de-differenziare astrociti4; 2) evita bolle nelle soluzioni che contengono il tessuto o le cellule, che possono cambiare il pH e ostacolare la salute di astrociti; 3) pre-riequilibranti media per raggiungere il pH ottimale e la temperatura per la crescita sani…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo che finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (7 ° PQ/260916), Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) e il Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE1951 e SFB889).
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco | 25300054 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | warm in 37 ºC waterbath before use |
| B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | 50X stock |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 100X stock |
| Penicillin / streptomycin | Gibco | 15070-063 | 50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 µg/ml |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | without L-glutamine |
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| HBEGF | Sigma | 4643 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HBSS | Gibco | 14170112 | |
| FCS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Gibco | 10010049 | 1X |
| 100 μm nylon cell strainer | BD | 352360 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Hera Cell 240i cell culture incubator | |
| Laboratory shaker | Heidolph | Rotamax 120 | use inside cell culture incubator |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R |
References
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