उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी विश्लेषण और Synaptosomal डोपामाइन Dopaminergic के उपयोग द्वारा चूहों में Homeostasis का आकलन
Summary
Synaptosomal डोपामाइन तेज और उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी विश्लेषण striatal ऊतक में डोपामाइन ट्रांसपोर्टर और डोपामाइन के स्तर के समारोह का आकलन करके चूहों में डोपामाइन homeostasis की जांच करने के लिए प्रयोगात्मक उपकरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं, क्रमश. यहाँ हम डोपामाइन ऊतक सामग्री को मापने और डोपामाइन ट्रांसपोर्टर की कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल मौजूद.
Abstract
डोपामाइन (डीए) एक modulatory न्यूरोट्रांसमीटर मोटर गतिविधि को नियंत्रित करने, इनाम प्रक्रियाओं और संज्ञानात्मक समारोह है. dopaminergic की हानि (DAergic) neurotransmission दृढ़ता से कई केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के साथ जुड़ा हुआ है-पार्किंसंस रोग, ध्यान घाटे-सक्रियता विकार और मादक पदार्थों की लत के रूप में जुड़े रोगों1,2 ,3,4. Delineating रोग दा असंतुलन को शामिल तंत्र गंभीर रूप से बीमारियों के पहलुओं की नकल करने के लिए पशु मॉडलों पर निर्भर है, और इस प्रकार प्रोटोकॉल है कि डीए homeostasis के विशिष्ट भागों का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है उपंयास अंतर्दृष्टि और संभव चिकित्सकीय प्रदान इन रोगों के लिए लक्ष्य ।
यहां, हम दो उपयोगी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल है कि जब संयुक्त एक कार्यात्मक पढ़ने के चूहों में DAergic प्रणाली के बाहर प्रदान प्रस्तुत करते हैं । दा homeostasis पर जैव रासायनिक और कार्यात्मक मापदंडों दा स्तर और डोपामाइन ट्रांसपोर्टर (DAT) की कार्यक्षमता5के आकलन के माध्यम से प्राप्त कर रहे हैं । जब डीए प्रणाली की जांच करने की क्षमता को मज़बूती से वयस्क मस्तिष्क से दा के अंतर्जात स्तर को मापने के लिए आवश्यक है । इसलिए, हम वर्तमान कैसे चूहों से मस्तिष्क ऊतक पर उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) प्रदर्शन करने के लिए दा के स्तर का निर्धारण करने के लिए । हम पृष्ठीय striatum (dStr) और नाभिक accumbens (एनएसी) से ऊतक पर प्रयोग करते हैं, लेकिन विधि भी अन्य दा-innervated मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए उपयुक्त है.
DAT presynaptic टर्मिनल में डीए की reuptake के लिए आवश्यक है, जिससे जारी डा के लौकिक और स्थानिक गतिविधि को नियंत्रित । striatum में DAT के स्तर और कार्यशीलता को जानने के प्रमुख महत्व का है जब डीए homeostasis का आकलन । यहां, हम एक प्रोटोकॉल है कि एक साथ सतह के स्तर और एक synaptosomal6 डीए का उपयोग परख का प्रयोग समारोह के बारे में जानकारी निकालना की अनुमति देता है प्रदान करते हैं ।
वर्तमान मानक immunoblotting प्रोटोकॉल के साथ संयुक्त तरीके प्रासंगिक उपकरण के साथ शोधकर्ता प्रदान करने के लिए DAergic प्रणाली की विशेषता ।
Introduction
डोपामाइन (डीए) मोटर व्यवहार, इनाम और संज्ञानात्मक समारोह1,7,8,9के लिए एक modulatory न्यूरोट्रांसमीटर महत्वपूर्ण है । डीए homeostasis में असंतुलन कई neuropsychiatric रोगों में फंसाया जाता है जैसे ध्यान घाटे सक्रियता विकार, मादक पदार्थों की लत, अवसाद और पार्किंसंस रोग1। दा presynaptic ंयूरॉन से synaptic फांक में जारी है, जहां यह बांधता है और पूर्व और postsynaptic झिल्ली पर रिसेप्टर्स सक्रिय करता है, जिससे आगे संकेत संदेश । रिहाई के बाद synapse में डीए का स्तर स्थानिक और अस्थाई DAT द्वारा नियंत्रित है3,10। ट्रांसपोर्टर sequesters extracellular अंतरिक्ष से डा, और इस प्रकार शारीरिक दा स्तर3,11बनाए । चूहों में DAT के आनुवंशिक हटाने एक hyperdopaminergic phenotype ऊंचा synaptic दा स्तर, intracellular दा पूल और postsynaptic DAergic संकेत में गहन परिवर्तन की कमी की विशेषता का कारण बनता है10,12.
यहां, दो अलग प्रोटोकॉल प्रस्तुत कर रहे हैं, एक विधि दा ऊतक सामग्री को मापने के लिए और एक और DAT की कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए । सतह biotinylation गेब्रियल एट अल द्वारा वर्णित परख के साथ संयुक्त ।13 इन दो विधियों दा पर जानकारी प्रदान दा homeostasis के एक गहन आकलन के लिए DAT की सामग्री और कार्यात्मक स्तर । इन तरीकों के साथ दा homeostasis विभिन्न ट्रांसजेनिक चूहों या रोग मॉडल की विशेषता और वर्णन किया जा सकता है. इन उपकरणों को लागू किया गया है और अनुकूलित और हमारी प्रयोगशालाओं में मानक का उपयोग कर रहे हैं । वर्तमान परख सी DAT14 या tyrosine hydroxylase (गु) प्रमोटर 5के तहत Cre recombinase व्यक्त की सी टर्मिनल में फेरबदल के डीए homeostasis पर परिणाम की जांच करने के लिए कार्य किया है ।
Protocol
डेनिश पशु प्रयोग निरीक्षणालय के दिशानिर्देश (अनुमति संख्या: 2017-15-0201-01160) का पालन किया गया था और एक स्थानीय पशु कल्याण की देखरेख में एक पूरी तरह से AAALAC मान्यता प्राप्त सुविधा में प्रदर्शन किया प्रयोगों समि?…
Representative Results
Discussion
यह पांडुलिपि पसंद के किसी भी माउस मॉडल में चित्रित दा homeostasis के लिए उपयोगी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन है । हम DAT के माध्यम से कार्यात्मक डीए परिवहन का आकलन करने के लिए HPLC और synaptosomal दा के साथ का उपयोग कर चूह…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम उत्कृष्टता के UCPH २०१६ कार्यक्रम (U.G., A.R., K.J.), Lundbeck फाउंडेशन (यूननट) Lundbeck में Nanomedicine फाउंडेशन केंद्र (U.G.), राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान P01 डीए १२४०८ (U.G.), के डेनमार्क द्वारा समर्थित किया गया काउंसिल फॉर इंडिपेंडेंट रिसर्च-मेडिकल साइंसेज (U.G.) ।
Materials
| COMT inhibitor | Sigma Aldrich, Germany | RO-41-0960 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| [3H]-Dopamine | Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA | NET67-3001MC | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Glass microfiber filters | GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire | 1822-024 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HiSafe Scintillation fluid | Perkin Elmer | 1200-437 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MicroBeta2 | Perkin Elmer | For synaptosomal DA uptake protocol | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific Pierce | 23225 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Sucrose | Sigma Life Science | S7903 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| NaCl | Sigma Life Science | S3014 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| KCl | Sigma Life Science | P9541 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| CaCl2 | Merck KGaA | 10043-52-4 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MgSO4 | Sigma Life Science | 63065 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Ascorbic Acid | Sigma Life Science | A0278 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| D-Glucose | Sigma Life Science | G7021 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Desipramine | Sigma Aldrich | D3900 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Dopamine | Sigma Life Science | H8502 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cocaine | Sigma Life Science | C5776 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Brain matrix | ASI instruments | RBM2000C | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cafano mechanical teflon disrupter | Buch & Holm | Discontinued | For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization) |
| Antec Decade (Amperometric detector) | Antec, Leiden, The Netherlands | Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
| Avantec 0.22 μm glass filter | Frisenette ApS, Denmark | 13CP020AS | For HPLC protocol |
| Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany | Part Number:00A-3300-E0 | For HPLC protocol |
| LC solution software | Shimadzu | LabSolutions Series Workstation | For HPLC protocol |
| Perchlor acid 0.1M | Fluka Analytical | 35418-500ml | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| EDTA | Sigma | E5134-50g | For HPLC protocol |
| Natriumdihydrogenphosphar | Bie&Berntsen | 1.06346 1000g | For HPLC protocol |
| Sodium 1-octanesulfonate monohydrate | Aldrich | 74885 -10g | For HPLC protocol |
| Acetonitrile, isocratic HPLC grade | Scharlau | AC03402500 | For HPLC protocol |
| Filtre 0.22um | Frisenette ApS, Denmark | Avantec 13CP020AS | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| ortho-Phosphoric acid 85% | Merck | 1.00563. 1000ml | For HPLC protocol |
| Electrode | Antec, Leiden, The Netherlands | AN1161300 | For HPLC protocol (see manual online) |
| Detector program on DECADE II electrochemical detector | Antec, Leiden, The Netherlands | Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
References
- Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum. Neuron. 76, 33-50 (2012).
- Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
- Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63, 585-640 (2011).
- Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Monoamine transporters: from genes to behavior. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 261-284 (2003).
- Runegaard, A. H., et al. Preserved dopaminergic homeostasis and dopamine-related behaviour in hemizygous TH-Cre mice. Eur J Neurosci. 45, 121-128 (2017).
- Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles (‘synaptosomes’). Biochem J. 90, 293-303 (1964).
- Hornykiewicz, O. Dopamine (3-hydroxytyramine) and brain function. Pharmacol Rev. 18, 925-964 (1966).
- Schultz, W. Behavioral dopamine signals. Trends Neurosci. 30, 203-210 (2007).
- Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
- Giros, B., Jaber, M., Jones, S. R., Wightman, R. M., Caron, M. G. Hyperlocomotion and indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter. Nature. 379, 606-612 (1996).
- Torres, G. E., Amara, S. G. Glutamate and monoamine transporters: new visions of form and function. Curr Opin Neurobiol. 17, 304-312 (2007).
- Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4029-4034 (1998).
- Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. , (2014).
- Rickhag, M., et al. A C-terminal PDZ domain-binding sequence is required for striatal distribution of the dopamine transporter. Nat Commun. 4, 1580 (2013).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
- Whittaker, V. P. Thirty years of synaptosome research. J Neurocytol. 22, 735-742 (1993).
- Schmitz, Y., Benoit-Marand, M., Gonon, F., Sulzer, D. Presynaptic regulation of dopaminergic neurotransmission. J Neurochem. 87, 273-289 (2003).
- Yang, L., Beal, M. F. Determination of neurotransmitter levels in models of Parkinson’s disease by HPLC-ECD. Methods Mol Biol. 793, 401-415 (2011).
- Earles, C., Schenk, J. O. Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation. Anal Biochem. 264, 191-198 (1998).
- Wu, Q., Reith, M. E., Kuhar, M. J., Carroll, F. I., Garris, P. A. Preferential increases in nucleus accumbens dopamine after systemic cocaine administration are caused by unique characteristics of dopamine neurotransmission. J Neurosci. 21, 6338-6347 (2001).
- Schonfuss, D., Reum, T., Olshausen, P., Fischer, T., Morgenstern, R. Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo. J Neurosci Methods. 112, 163-172 (2001).
- Hoover, B. R., Everett, C. V., Sorkin, A., Zahniser, N. R. Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations. J Neurochem. 101, 1258-1271 (2007).
- Hansen, F. H., et al. Missense dopamine transporter mutations associate with adult parkinsonism and ADHD. J Clin Invest. 124, 3107-3120 (2014).
- Damier, P., Hirsch, E. C., Agid, Y., Graybiel, A. M. The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson’s disease. Brain. 122 (Pt 8), 1437-1448 (1999).
- Atack, C. V. The determination of dopamine by a modification of the dihydroxyindole fluorimetric assay. Br J Pharmacol. 48, 699-714 (1973).
- Yoshitake, T., et al. High-sensitive liquid chromatographic method for determination of neuronal release of serotonin, noradrenaline and dopamine monitored by microdialysis in the rat prefrontal cortex. J Neurosci Methods. 140, 163-168 (2004).
- Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P., Bjorklund, A. Progressive neurodegenerative and behavioural changes induced by AAV-mediated overexpression of alpha-synuclein in midbrain dopamine neurons. Neurobiol Dis. 45, 939-953 (2012).
- Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. L-DOPA pharmacokinetics in the MPTP-lesioned macaque model of Parkinson’s disease. Neuropharmacology. 63, 829-836 (2012).
- Mikkelsen, M., et al. MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study. Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).
- Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. Comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area. J Vis Exp. , (2012).
- Van Dam, D., et al. Regional distribution of biogenic amines, amino acids and cholinergic markers in the CNS of the C57BL/6 strain. Amino Acids. 28, 377-387 (2005).
- Barth, C., Villringer, A., Sacher, J. Sex hormones affect neurotransmitters and shape the adult female brain during hormonal transition periods. Front Neurosci. 9 (37), (2015).
- Corthell, J. T., Stathopoulos, A. M., Watson, C. C., Bertram, R., Trombley, P. Q. Olfactory bulb monoamine concentrations vary with time of day. Neurosciences. 247, 234-241 (2013).
- Zhuang, X., et al. Hyperactivity and impaired response habituation in hyperdopaminergic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1982-1987 (2001).
- Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30, 44-55 (1974).
- Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats. J Vis Exp. , e52468 (2015).
- Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
- Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry. Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).
