Синаптосомальных допамина поглощения и жидкостной хроматографии высокой производительности представляют экспериментальные инструменты для анализа расследовать допамина гомеостаза у мышей путем оценки функции транспортер дофамина и уровни допамина в полосатой ткани, соответственно. Здесь мы представляем протоколы измерения содержания дофамина ткани и оценить функциональность транспортер дофамина.
Допамин (DA) является модулирующее нейромедиатором контроль двигательной активности, вознаграждение процессы и когнитивные функции. Обесценение синапсах дофаминергической (DAergic) прочно ассоциируется с несколькими центральной нервной системы ассоциированных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона, внимание дефицит гиперактивностью и зависимость от наркотиков1,2 ,3,4. Разграничение болезни механизмов с участием DA дисбаланс зависит критически животных моделей имитировать аспекты заболеваний, и таким образом протоколы, которые оценить конкретные части гомеостаза да важно предоставить новые идеи и возможности терапевтического цели для этих заболеваний.
Здесь, мы представляем две полезные экспериментальные протоколы что, при сочетании обеспечивают функциональные считывания DAergic системы у мышей. Биохимических и функциональных параметров гомеостаза да получаются путем оценки уровней да и допамина транспортера (DAT) функциональность5. При расследовании да системы, способность надежно измерять эндогенными уровнями да от взрослого мозга имеет важное значение. Таким образом мы представляем как для выполнения высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на ткани головного мозга от мышей для определения уровней DA. Мы проводим эксперимент на ткани от дорсальной стриатума (р) и прилежащем ядре (NAc), но метод подходит также для других областей DA-иннервируются мозга.
DAT имеет важное значение для reuptake Да в пресинаптическом терминал, таким образом контролируя временных и пространственных активность выпустила DA. Зная, уровни и функциональность DAT в стриатума имеет большое значение при оценке да гомеостаза. Здесь мы предоставляем протокол, который позволяет одновременно выводить информацию о поверхности земли и функции с помощью пробирного поглощение синаптосомальных6 да.
Нынешние методы в сочетании со стандартной immunoblotting протоколы обеспечивают исследователь с соответствующими инструментами для характеристики системы DAergic.
Допамин (DA) является критической для моторное поведение, вознаграждение и когнитивные функции1,,78,9модулирующее нейромедиатором. Дисбаланс в DA гомеостаза причастны несколько нервно-психических заболеваний, как синдром дефицита внимания и гиперактивности, наркомания, депрессия и болезни Паркинсона1. Да освобождается от Пресинаптический нейрон в синаптическую щель, где он связывает и активирует рецепторы на предварительной и постсинаптической мембраны, тем самым дальнейшей передачи сигнала. Уровень Да в синапсе после выпуска пространственно и временно управляется DAT3,10. Транспортер секвестров да из внеклеточного пространства и таким образом поддерживает да физиологические уровни3,11. Генетическая удаление DAT в мышей вызывает дофамина фенотип характеризуется повышенными уровнями синаптических Да, истощения внутриклеточных да бассейнов и глубокие изменения в постсинаптической DAergic сигнализации10,12.
Здесь представлены два отдельных протоколов, один метод измерения да ткань содержание и другой, чтобы оценить функциональность DAT. совмещенное с поверхности biotinylation assay, описываемого Габриэль et al.13 эти два методы предоставляют информацию о да содержание и функциональные уровни DAT для тщательной оценки да гомеостаза. С помощью этих методов да гомеостаза различных трансгенных мышей или модели заболеванием можно охарактеризовать и описаны. Эти инструменты были реализованы и оптимизированы и стандартного использования в наших лабораториях. Текущие исследования служили исследовать последствия на DA гомеостаза изменяя C-терминал DAT14 или выражая Cre рекомбиназа под тирозин гидроксилазы (TH) промоутер 5.
Эта рукопись описывает полезными экспериментальные протоколы разграничить да гомеостаза в любой мыши модели выбора. Мы предоставляем подробные протоколы для измерения уровней Да в ткани мозга от мышей с помощью ВЭЖХ и синаптосомальных да поглощения для оценки функциональных да тран?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана UCPH 2016 Программа Excellence (уг, а.р., К.Я), Lundbeck Foundation (м.р.) Lundbeck фонд центр биомембран в наномедицины (уг), национального института из здравоохранения грантов P01 да 12408 (уг), датский Совет независимых исследований – медицинских наук (уг).
COMT inhibitor | Sigma Aldrich, Germany | RO-41-0960 | For synaptosomal DA uptake protocol |
[3H]-Dopamine | Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA | NET67-3001MC | For synaptosomal DA uptake protocol |
Glass microfiber filters | GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire | 1822-024 | For synaptosomal DA uptake protocol |
HiSafe Scintillation fluid | Perkin Elmer | 1200-437 | For synaptosomal DA uptake protocol |
MicroBeta2 | Perkin Elmer | For synaptosomal DA uptake protocol | |
BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific Pierce | 23225 | For synaptosomal DA uptake protocol |
HEPES | Sigma Life Science | H3375 | For synaptosomal DA uptake protocol |
Sucrose | Sigma Life Science | S7903 | For synaptosomal DA uptake protocol |
NaCl | Sigma Life Science | S3014 | For synaptosomal DA uptake protocol |
KCl | Sigma Life Science | P9541 | For synaptosomal DA uptake protocol |
CaCl2 | Merck KGaA | 10043-52-4 | For synaptosomal DA uptake protocol |
MgSO4 | Sigma Life Science | 63065 | For synaptosomal DA uptake protocol |
Ascorbic Acid | Sigma Life Science | A0278 | For synaptosomal DA uptake protocol |
D-Glucose | Sigma Life Science | G7021 | For synaptosomal DA uptake protocol |
Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | For synaptosomal DA uptake protocol |
Desipramine | Sigma Aldrich | D3900 | For synaptosomal DA uptake protocol |
Dopamine | Sigma Life Science | H8502 | For synaptosomal DA uptake protocol |
Cocaine | Sigma Life Science | C5776 | For synaptosomal DA uptake protocol |
Brain matrix | ASI instruments | RBM2000C | For synaptosomal DA uptake protocol |
Cafano mechanical teflon disrupter | Buch & Holm | Discontinued | For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization) |
Antec Decade (Amperometric detector) | Antec, Leiden, The Netherlands | Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
Avantec 0.22 μm glass filter | Frisenette ApS, Denmark | 13CP020AS | For HPLC protocol |
Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany | Part Number:00A-3300-E0 | For HPLC protocol |
LC solution software | Shimadzu | LabSolutions Series Workstation | For HPLC protocol |
Perchlor acid 0.1M | Fluka Analytical | 35418-500ml | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
EDTA | Sigma | E5134-50g | For HPLC protocol |
Natriumdihydrogenphosphar | Bie&Berntsen | 1.06346 1000g | For HPLC protocol |
Sodium 1-octanesulfonate monohydrate | Aldrich | 74885 -10g | For HPLC protocol |
Acetonitrile, isocratic HPLC grade | Scharlau | AC03402500 | For HPLC protocol |
Filtre 0.22um | Frisenette ApS, Denmark | Avantec 13CP020AS | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
ortho-Phosphoric acid 85% | Merck | 1.00563. 1000ml | For HPLC protocol |
Electrode | Antec, Leiden, The Netherlands | AN1161300 | For HPLC protocol (see manual online) |
Detector program on DECADE II electrochemical detector | Antec, Leiden, The Netherlands | Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |