Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera met een Sialoglycan Microarray Assay
Summary
Een sialoglycan microarray test kan gebruikt worden om anti-Neu5Gc antilichamen in humane sera te evalueren, waardoor het een potentiële diagnostische test voor kanker en andere chronische ontstekingsgemedieerde menselijke ziekten is.
Abstract
Cellen zijn bedekt met een mantel koolhydratenketens (glycanen) die gewoonlijk veranderd zijn in kanker en die variaties in siaalzuur (Sia) expressie omvatten. Dit zijn zure suikers die een 9-carbon ruggengraat hebben en die vertebraten glycanen op de celoppervlakken dichten. Twee van de belangrijkste Sia-vormen in zoogdieren zijn N- acetylneuraminezuur (Neu5Ac) en zijn gehydroxyleerde vorm, N- glycolylneuraminezuur (Neu5Gc). Mensen kunnen geen endogene Neu5Gc produceren door de inactivatie van het gen dat codeert voor cytidine 5'monofosfaat-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hydroxylase (CMAH). Buitenlandse Neu5Gc wordt verkregen door menselijke cellen door het dieetverbruik van rood vlees en zuivel en verschijnt vervolgens op diverse glycanen op het celoppervlak, die hoofdzakelijk op carcinomen accumuleren. Derhalve hebben mensen circulerende anti-Neu5Gc antilichamen die verschillende rollen spelen in kanker en andere chronische ontstekingsgemedieerde aandoeningen en die potentieel diagnostisch en therapeutisch worden.rgets. Hier beschrijven we een high-throughput sialoglycan microarray test om dergelijke anti-Neu5Gc antilichamen in de menselijke sera te beoordelen. Neu5Gc-bevattende glycanen en hun bijpassende paren controles (Neu5Ac-bevattende glycanen), elk met een kern primaire amine, zijn covalent gekoppeld aan epoxy-beklede glazen glijbanen. We illustreren het afdrukken van 56 glijbanen in een 16-bronsformaat met behulp van een specifieke nano-printer die maximaal 896 array's per print kan genereren. Elke dia kan worden gebruikt om 16 verschillende humane sera monsters te screenen voor de evaluatie van anti-Neu5Gc antilichaam specificiteit, intensiteit en diversiteit. Het protocol beschrijft de complexiteit van dit robuuste gereedschap en biedt een basis richtlijn voor degenen die het antwoord op Neu5Gc dieet koolhydraatantigen in diverse klinische monsters in een matrixformaat willen onderzoeken.
Introduction
Sias zijn zure suikers die glycan ketens op glycoproteïnen op glycoproteïnen en glycolipiden in vertebraten omvatten. Sia expressie is gemodificeerd in kankercellen 1 en correleert met progressie en / of metastase 2 , 3 . Twee van de belangrijkste Sia-vormen in zoogdieren zijn Neu5Ac en zijn gehydroxyleerde vorm, Neu5Gc 2 . Mensen kunnen Neu5Gc niet synthetiseren door een specifieke inactivatie van het gen dat codeert voor het CMAH-enzym. Deze niet-humane Sia bevat metabolisch in menselijke cellen als 'zelf', afkomstig van voedings Neu5Gc-rijke voedingsmiddelen ( bijv. Rood vlees) 4 , 5 . Neu5Gc is aanwezig op lage niveaus op de celoppervlakken van menselijke epithelia en endothelia, maar komt vooral bij carcinomen op. Neu5Gc wordt herkend als vreemd door het humane humoral immune system 2 , 6 .De antigeencomplexiteit van Neu5Gc-glycanen kan zich op meerdere niveaus voordoen, inclusief Neu5Gc-modificatie, koppeling, onderliggende glycanen en steigers, en hun dichtheid, die allemaal weerspiegeld worden door de complexiteit van anti-Neu5Gc antilichaamrespons bij mensen 6 . Sommige van deze antilichamen dienen als carcinombiomarkers en potentiële immunotherapeutica 7 . De komst van de chemo-zymatische synthese van verschillende sialoglycanen 8 heeft de weg geboden voor de diepgaande analyse van dergelijke antilichamen, gefaciliteerd door het gebruik van glycan microarray technologie 9 , 10 . Dus, met de gefaciliteerde voorbereiding en manipulatie van grote bibliotheken van natuurlijke en synthetische koolhydraten, zijn glycan microarrays een krachtige high-throughput technologie geworden voor het onderzoeken van de interacties van koolhydraten met een groot aantal biomoleculen 10 , 11 , </sup> 12 , 13 . In een matrixformaat worden minimale hoeveelheden materialen gebruikt, en dit multivalente display van biologisch relevante glycanen zorgt voor het onderzoek naar duizenden bindende interacties in een enkel experiment. Belangrijk is dat deze technologie ook kan worden toegepast op biomarker ontdekking en het controleren van immuunresponsen in diverse monsters 7 , 12 .
Succesvolle glycan microarray fabricage vereist het overwegen van drie belangrijke aspecten: het type printer robot, glycan conjugation chemistry en detectie optica. Met betrekking tot het afdrukinstrument zijn twee technieken beschikbaar: contact- en niet-contactprinters. In contactdruk worden 1-48 stalen pennen gedompeld in een multi-well bronplaat die glycanoplossing bevat en worden gespot op gefunctionaliseerde glijbanen door direct contact op te nemen met het glazen glijvlak. De oplossing bedraagt deLevering aan de dia is een functie van de langdurige duur op het dia oppervlak. Meestal worden de monsters eerst voorgespoten op een glasblok (om homogene plekken te bereiken) voordat ze op het dia-oppervlak worden gedrukt. Bij niet-contactprinters ( bijv. De piezo-elektronische printer) worden de glycanen gedrukt vanuit een glazen capillaire met behulp van gecontroleerde elektrische signalen. Het elektrische signaal kan fijn gekalibreerd worden om nauwkeuriger afdrukken te verkrijgen ten opzichte van het afdrukken van contacten. De grootte en morfologie van de vlekken zijn ook relatief meer homogeen. Een extra voordeel is het recyclen van het monster terug naar de bronplaat na het afdrukken. Niettemin is het grote nadeel van piëzo-elektronische printers de drukknopbeperking (4 of 8), wat resulteert in een zeer lange drukduur, waarbij speciale aandacht moet worden besteed aan de stabiliteit, de temperatuur, de vochtigheid en de verdamping van het monster. De non-contact inkjetprinter vereist grotere voorbeeldvolumes 14 .
<p class = "jove_content"> In tegenstelling tot de beperkte beschikbare opties voor drukwerkmethoden, is de glycan conjugation chemistry een complexere overweging, met veel mogelijkheden om uit te kiezen. Geselecteerde immobilisatiechemie moet rekening houden met zowel de actieve groepen op de glycanen als de reactiviteit van de glijoppervlak. De glycanen die geïmmobiliseerd moeten worden op een specifiek microarray oppervlak, ofwel synthetisch gesynthetiseerd of natuurlijk geïsoleerd, hebben allemaal een identieke reactieve groep nodig. Bovendien moeten de glycanen zuiver en homogeen zijn. Aan de andere kant moet het immobilisatieoppervlak en de chemie reproduceerbaarheid en betrouwbare bevestigingsdichtheid verschaffen. Meerdere immobilisatiemethoden zijn ontwikkeld met ofwel covalente of niet-covalente (fysieke absorptie) bijlage 10 , 11 , 12 , 13 . Voor zeer gedetailleerde informatie over gedrukte glycan microarray technologie voor de oninitiateD-onderzoeker, verwijzen naar deze uitstekende beoordelingen 13 , 15 . Belangrijk is dat de recente Minimale Informatie Verplicht voor een Glycomics Experiment (MIRAGE) initiatief omschrijft richtlijnen voor steekproefbereiding 16 en voor het rapporteren van gegevens uit glycan microarray analyses 17 om de normen in dit groeiende veld te verbeteren.Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de fabricage van sialoglycan microarrays met behulp van een specifieke contact nano-printer in een 16-vel formaat. Elk van de glycanen heeft een primaire amine die hun covalente verbinding met epoxy geactiveerde glazen glijbanen bemiddelt. We beschrijven ook de ontwikkeling en analyse van een dia met behulp van diverse menselijke sera-monsters, antilichamen en Sia-bindende plantentectines. Sialoglycan microarray analyses betreffen meerdere belangrijke stappen die matrix fabricage, verwerking, ontwikkeling en analyse omvatten. Array fabricage vereist de planning van de arRay-lay-out, bereiding van de glycanen en bronplaat, het programmeren van de nano-printer en het afdrukken van de dia's. Vervolgens worden de dia's verwerkt, ontwikkeld en geanalyseerd ( Figuur 1 ).
Protocol
Representative Results
Discussion
Een succesvolle glycan microarray fabricage vereist een zorgvuldige planning en bevat diverse belangrijke stappen in het protocol. Deze omvatten: (1) het plannen van de blok- en plaatlayouts die alle volgende parameters bepalen ( bijv. Afstanden, afstand, hoeveelheid monsters en afdrukken); (2) het schoonmaken van de pennen en het waarborgen van de pin integriteit, die van cruciaal belang is voor het controleren van spot homogeniteit; (3) het handhaven van hoge vochtigheid tijdens het printen, kritisch om vermi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een Research Career Development Award van het Israël Cancer Research Fund, een subsidie van het Israëlische National Nanotechnology Initiative en het Helmsley Charitable Trust voor een focal technologiegebied op Nanomedicines for Personalized Theranostics (VP-K) en National Instituten van Gezondheidstoelaag R01GM076360 (naar XC).
Materials
| Primary-amine containing sialoglycans | Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services) | Contact info@glycohubusa.com for compound requests | Printed glycans |
| Monosodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | Printing buffer component |
| Disodium phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | Printing buffer component |
| Phosphate buffered saline | Hy-Labs | BP-507/500D | Printing buffer/ incubation/washing buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Slide blocking reagent |
| Glycerol | Sigma | G-7893 | Printing buffer component |
| Ethanolamine | Thermo-Fisher Scientific | 0700/08 | Slide blocking reagent |
| Ovalbumin (Grade V) | Sigma | A5503 | Slide Blocking protein |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | Slide washing detergent |
| Alexa 555-Hydrazide | Thermo-Fisher Scientific | A20501MP | Marker on array |
| ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Printing component |
| Biotinylated- SNA | Vector Laboratories | B-1305 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–6-linked |
| Biotinylated-MALII | Vector Laboratories | B-1265 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–3-linked |
| Chicken-anti Neu5Gc IgY | BioLegend | 146903 | Primary detection |
| Cy3-Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-0848 | Biotin binding |
| Cy3-anti Human IgG | Jackson Immunoresearch | 109-165-088 | Secondary detection against human IgG |
| Cy3-anti Chicken IgY | Jackson Immunoresearch | 703-165-155 | Secondary detection against chicken IgY |
| Human sera samples | Israeli Blood Bank | Primary detection | |
| Compressed Nitrogen (Grade 5) | General dusting/drying tool | ||
| Epoxy-coated slides | Corning | 40044 | Slides |
| Epoxy-coated slides | PolyAn | 2D 104-00-221 | Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 µm size spots. |
| 384-well microtiter plate | Genetix | 2070 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-310 | Slide labeling |
| Staining Tube | ArrayIt | MST | Slide developing tool |
| Staining bath | VWR | 25608-904 | Slide developing tool |
| Slides glass holders | VWR | 631-9321 | Slide developing tool |
| GenePix Scanner | Molecular devices | 4000B | Slide scanner |
| LM-60 NanoPrinter | ArrayIt | LM-60 | Array printer |
| Pins | ArrayIt | 946MP3 | Printing pins |
| ProPlate Module | Grace Bio-Labs | P37004 | Slide developing module |
| Distilled water | Bio-Lab | 2321020500 | Required for arrayer and humidifier |
| Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 μL | Thermo-Fisher Scientific (Matrix) | MA-2131 Impact2 Equalizer 384 | Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate |
References
- Padler-Karavani, V. Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine. Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).
- Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye, ., Padler-Karavani, S., V, Glycans in immune recognition and response. Carbohydr Res. 389, 115-122 (2014).
- Häuselmann, I., Borsig, L. Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis. Front Oncol. 4, (2014).
- Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (21), 12045-12050 (2003).
- Bardor, M., Nguyen, D. H., Diaz, S., Varki, A. Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells. J Biol Chem. 280 (6), 4228-4237 (2005).
- Padler-Karavani, V., et al. Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: potential implications for disease. Glycobiology. 18 (10), 818-830 (2008).
- Padler-Karavani, V., et al. Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer. Cancer Res. 71 (9), 3352-3363 (2011).
- Cao, H., Chen, X. General consideration on sialic acid chemistry. Methods Mol Biol. 808, 31-56 (2012).
- Deng, L., Chen, X., Varki, A. Exploration of sialic Acid diversity and biology using sialoglycan microarrays. Biopolymers. 99 (10), 650-665 (2013).
- Liang, C. H., Hsu, C. H., Wu, C. Y. Sialoside Arrays: New Synthetic Strategies and Applications. Top Curr Chem. 367, 125-149 (2015).
- Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Smith, D. F., Cummings, R. D. Glycan microarrays of fluorescently-tagged natural glycans. Glycoconj J. 32 (7), 465-473 (2015).
- Muthana, S. M., Gildersleeve, J. C. Glycan microarrays: powerful tools for biomarker discovery. Cancer Biomark. 14 (1), 29-41 (2014).
- Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
- Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F., Cummings, R. D. Preparation and analysis of glycan microarrays. Curr Protoc Protein Sci. 12 (10), (2011).
- Park, S., Gildersleeve, J. C., Blixt, O., Shin, I. Carbohydrate microarrays. Chem Soc Rev. 42 (10), 4310-4326 (2013).
- Struwe, W. B., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: sample preparation guidelines for reliable reporting of glycomics datasets. Glycobiology. 26 (9), 907-910 (2016).
- Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. , (2016).
- Hara, S., Yamaguchi, M., Takemori, Y., Furuhata, K., Ogura, H., Nakamura, M. Determination of mono-O-acetylated N-acetylneuraminic acids in human and rat sera by fluorometric high-performance liquid chromatography. Anal Biochem. 179 (1), 162-166 (1989).
- Padler-Karavani, V., et al. Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays. J Biol Chem. 287 (27), 22593-22608 (2012).
- Padler-Karavani, V., Varki, A. Potential impact of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid on transplant rejection risk. Xenotransplantation. 18 (1), 1-5 (2011).
- Samraj, A. N., et al. A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (2), 542-547 (2015).
- Pearce, O. M., Läubli, H. Sialic acids in cancer biology and immunity. Glycobiology. 26 (2), 111-128 (2016).
- Alisson-Silva, F., Kawanishi, K., Varki, A. Human risk of diseases associated with red meat intake: Analysis of current theories and proposed role for metabolic incorporation of a non-human sialic acid. Mol Aspects Med. 51, 16-30 (2016).
- Pearce, O. M., et al. Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (16), 5998-6003 (2014).
- Pham, T., et al. Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium. Blood. 114 (25), 5225-5235 (2009).
- Reuven, E. M., et al. Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves. Xenotransplantation. 23 (5), 381-392 (2016).
- Ghaderi, D., Taylor, R. E., Padler-Karavani, V., Diaz, S., Varki, A. Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nat Biotechnol. 28 (8), 863-867 (2010).
