Profilare IgG anti-Neu5Gc in Sera umana con un assaggio microarray di Sialoglycan
Summary
Un saggio di microarray sialoglycan può essere utilizzato per valutare gli anticorpi anti-Neu5Gc nei sera umani, rendendolo un potenziale analisi diagnostica ad alto rendimento per il cancro e altre malattie umane mediate dall'infiammazione cronica.
Abstract
Le cellule sono coperte da un mantello di catene di carboidrati (glicani) che sono comunemente alterati nel cancro e che includono variazioni nell'espressione di acido sialico (Sia). Questi sono gli zuccheri acidi che hanno una spina dorsale di 9 carbonio e che il cappuccio vertebrare i glicani sulle superfici delle cellule. Due delle principali forme di Sia nei mammiferi sono l'acido N- acetilneuraminico (Neu5Ac) e la sua forma idrossilata, l'acido N- glycolylneuraminic (Neu5Gc). Gli umani non possono produrre Neu5Gc endogeno a causa dell'inattivazione del gene che codifica la citidina 5'monophosphate-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) idrossilasi (CMAH). Il Neu5Gc straniero viene acquisito dalle cellule umane attraverso il consumo alimentare di carne rossa e latticini e successivamente appare su diversi glicani sulla superficie cellulare accumulandosi principalmente sui carcinomi. Di conseguenza, gli esseri umani hanno anticorpi anti-Neu5Gc circolanti che svolgono diversi ruoli nel cancro e in altre malattie mediate da infiammazioni croniche e che stanno diventando potenziali diagnostiche e terapeutichergets. Qui descriviamo un test di microarray di Sialoglycan ad alta percentuale per valutare tali anticorpi anti-Neu5Gc nei sera umani. I glicanti contenenti Neu5Gc e le loro corrispondenti coppie di controlli (glicanti contenenti Neu5Ac), ognuno con un ammino primario di base, sono legati covalentemente a vetrini in vetro epossidico. Esempiamo la stampa di 56 diapositive in un formato a 16 pozzetti utilizzando una specifica stampante nano in grado di generare fino a 896 array per stampa. Ogni diapositiva può essere utilizzata per la visualizzazione di 16 diversi campioni di sera umani per la valutazione della specificità, intensità e diversità degli anticorpi anti-Neu5Gc. Il protocollo descrive la complessità di questo strumento robusto e fornisce una guida di base per coloro che intendono indagare la risposta all'antigene carboidrato alimentare Neu5Gc in diversi campioni clinici in un formato di matrice.
Introduction
Sias sono zuccheri acidi che coprono catene di glicamine sulle glicoproteine delle superfici cellulari e sui glicolipidi nei vertebrati. L'espressione Sia è modificata nelle cellule tumorali 1 e si correlano con la progressione e / o la metastasi 2 , 3 . Due delle principali forme Sia nei mammiferi sono Neu5Ac e la sua forma idrossilata, Neu5Gc 2 . Gli esseri umani non possono sintetizzare Neu5Gc a causa di una inattivazione specifica del gene che codifica l'enzima CMAH. Questa non umana Sia mette metabolicamente in cellule umane come "sé", proveniente da alimenti ricchi di nutrienti Neu5Gc ( es. Carni rosse) 4 , 5 . Neu5Gc è presente a bassi livelli sulle superfici cellulari dell'epitelio umano e dell'endotelina, ma si accumula soprattutto nei carcinomi. Neu5Gc è riconosciuto come straniero dal sistema immunitario humorale 2 , 6 .La complessità antigenica di Neu5Gc-glicani può avvenire a più livelli, tra cui la modifica di Neu5Gc, il legame, i glicanti sottostanti e gli scaffold e la loro densità, tutti riflessi dalla complessità della risposta anticorpale anti-Neu5Gc negli esseri umani 6 . Alcuni di questi anticorpi servono come biomarcatori del carcinoma e immunoterapia potenziale 7 . L'avvento della sintesi chemoenzimatica di diversi sialicani 8 ha aperto la strada all'analisi più approfondita di tali anticorpi, facilitata dall'utilizzo della tecnologia microarray a glicole 9 , 10 . Così, con la preparazione facilitata e la manipolazione di grandi librerie di carboidrati naturali e sintetici, i microarray glicanici sono diventati una potente tecnologia ad alto rendimento per indagare le interazioni dei carboidrati con una miriade di biomolecole 10 , 11 , </sup> 12 , 13 . In un formato a matrice vengono utilizzate quantità minime di materiali e questa visualizzazione multivalente di glicani biologicamente rilevanti consente di individuare migliaia di interazioni di legame in un singolo esperimento. Importante, questa tecnologia può essere applicata anche alla scoperta dei biomarker e al monitoraggio delle risposte immunitarie nei vari campioni 7 , 12 .
La fabbricazione di microarray di glico di successo richiede la considerazione di tre aspetti importanti: il tipo di robot della stampante, la chimica di coniugazione di glicole e l'ottica di rilevazione. Per quanto riguarda la tecnica dello strumento di stampa, sono disponibili due tecniche: contatti e stampanti non a contatto. Nella stampa a contatto, 1-48 pins d'acciaio vengono immersi in una piastra di fonte multi-well contenente la soluzione di glicina e sono scoperti su diapositive di vetro funzionalizzate direttamente contattando la superficie di scivolo in vetro. La quantità di soluzione deFegato alla diapositiva è una funzione della durata persistente sulla superficie di scorrimento. Di solito, i campioni vengono prima pre-macchiati su un blocco di vetro (per raggiungere macchie omogenee) prima che siano stampate sulla superficie di scorrimento. Nelle stampanti non a contatto ( ad esempio, la stampante piezo-elettronica), i glicani vengono stampati da un capillare di vetro utilizzando segnali elettrici controllati. Il segnale elettrico può essere calibrato finemente per ottenere una stampa più precisa rispetto alla stampa a contatto. La dimensione e la morfologia dei punti sono anche relativamente più omogenei. Un ulteriore vantaggio è il riciclo del campione di nuovo alla piastra di origine dopo la stampa. Tuttavia, il principale svantaggio delle stampanti piezoelettroniche è la limitazione delle punte di stampa (4 o 8), con una durata di stampa molto lunga, che richiede particolare attenzione alla stabilità della slitta, alla temperatura, all'umidità e all'evaporazione del campione. La stampante a getto d'inchiostro non contatto richiede maggiori volumi di campionamento 14 .
<p class = "jove_content"> A differenza delle limitate opzioni disponibili per i metodi di stampa, la chimica di coniugazione glicata è una considerazione più complessa, con molte opzioni da scegliere. La chimica di immobilizzazione selezionata deve tenere conto dei gruppi attivi sui glicani e della reattività della superficie di scorrimento. I glicani da immobilizzare su una specifica superficie microarray, sinteticamente sintetizzati o isolati naturalmente, richiedono tutti un gruppo reattivo identico. Inoltre, i glicani devono essere pura e omogenei. D'altra parte, la superficie di immobilizzazione e la chimica dovrebbero fornire riproducibilità e densità di attacco affidabile. Sono stati sviluppati più metodi di immobilizzazione con attaccamento covalente o non covalente (assorbimento fisico) 10 , 11 , 12 , 13 . Per informazioni dettagliate sulla tecnologia microarray a glicina stampata per l'inaugurazioneD investigatore, fare riferimento a queste eccellenti recensioni 13 , 15 . Importante, le recenti informazioni minime necessarie per un'iniziativa per esperimenti di Glycomics (MIRAGE) descrivono le linee guida per la preparazione dei campioni 16 e per la segnalazione di dati da analisi microarray a glicole 17 per migliorare gli standard in questo campo crescente.Qui descriviamo un protocollo dettagliato per la fabbricazione di microarray sialoglycan usando una specifica nano-stampante a contatto in un formato a 16 pozzetti. Ognuno dei glicani possiede un'ammina primaria che medierà il loro legame covalente alle vetrate in vetro epossidico. Descriviamo anche lo sviluppo e l'analisi di una sola diapositiva usando vari campioni di sera umani, anticorpi e lectini vegetali di Sia. I test di analisi microarray di Sialoglycan comportano diversi passi importanti che includono la fabbricazione, l'elaborazione, lo sviluppo e l'analisi di array. La fabbricazione dell'array richiede la pianificazione dell'arRay, preparando i glicani e la piastra sorgente, programmando la nano-stampante e stampando le diapositive. Successivamente, le diapositive vengono elaborate, sviluppate e analizzate ( Figura 1 ).
Protocol
Representative Results
Discussion
Una fabbricazione di microarray di glycan di successo richiede una pianificazione attenta e comprende diversi passaggi importanti nel protocollo. Questi includono: (1) pianificare i layout di blocco e piastre che definiscono tutti i parametri successivi ( ad esempio, distanze, spaziatura, quantità di campioni e stampa); (2) pulire i perni e garantire l'integrità del perno, che è fondamentale per controllare l'omogeneità spot; (3) mantenendo l'alta umidità durante la stampa, cruciale per evitare…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un premio per la ricerca della carriera di ricerca del Fondo Israel Cancer Research, una sovvenzione dell'Iniziativa Nazionale di Nanotecnologia Israeliana e della Helmsley Charitable Trust per un'Area Tecnologica Focale sulle Nanomedicine per la Theranostics Personalizzata (VP-K) e National Istituti di Salute concedono una sovvenzione R01GM076360 (a XC).
Materials
| Primary-amine containing sialoglycans | Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services) | Contact info@glycohubusa.com for compound requests | Printed glycans |
| Monosodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | Printing buffer component |
| Disodium phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | Printing buffer component |
| Phosphate buffered saline | Hy-Labs | BP-507/500D | Printing buffer/ incubation/washing buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Slide blocking reagent |
| Glycerol | Sigma | G-7893 | Printing buffer component |
| Ethanolamine | Thermo-Fisher Scientific | 0700/08 | Slide blocking reagent |
| Ovalbumin (Grade V) | Sigma | A5503 | Slide Blocking protein |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | Slide washing detergent |
| Alexa 555-Hydrazide | Thermo-Fisher Scientific | A20501MP | Marker on array |
| ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Printing component |
| Biotinylated- SNA | Vector Laboratories | B-1305 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–6-linked |
| Biotinylated-MALII | Vector Laboratories | B-1265 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–3-linked |
| Chicken-anti Neu5Gc IgY | BioLegend | 146903 | Primary detection |
| Cy3-Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-0848 | Biotin binding |
| Cy3-anti Human IgG | Jackson Immunoresearch | 109-165-088 | Secondary detection against human IgG |
| Cy3-anti Chicken IgY | Jackson Immunoresearch | 703-165-155 | Secondary detection against chicken IgY |
| Human sera samples | Israeli Blood Bank | Primary detection | |
| Compressed Nitrogen (Grade 5) | General dusting/drying tool | ||
| Epoxy-coated slides | Corning | 40044 | Slides |
| Epoxy-coated slides | PolyAn | 2D 104-00-221 | Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 µm size spots. |
| 384-well microtiter plate | Genetix | 2070 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-310 | Slide labeling |
| Staining Tube | ArrayIt | MST | Slide developing tool |
| Staining bath | VWR | 25608-904 | Slide developing tool |
| Slides glass holders | VWR | 631-9321 | Slide developing tool |
| GenePix Scanner | Molecular devices | 4000B | Slide scanner |
| LM-60 NanoPrinter | ArrayIt | LM-60 | Array printer |
| Pins | ArrayIt | 946MP3 | Printing pins |
| ProPlate Module | Grace Bio-Labs | P37004 | Slide developing module |
| Distilled water | Bio-Lab | 2321020500 | Required for arrayer and humidifier |
| Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 μL | Thermo-Fisher Scientific (Matrix) | MA-2131 Impact2 Equalizer 384 | Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate |
References
- Padler-Karavani, V. Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine. Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).
- Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye, ., Padler-Karavani, S., V, Glycans in immune recognition and response. Carbohydr Res. 389, 115-122 (2014).
- Häuselmann, I., Borsig, L. Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis. Front Oncol. 4, (2014).
- Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (21), 12045-12050 (2003).
- Bardor, M., Nguyen, D. H., Diaz, S., Varki, A. Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells. J Biol Chem. 280 (6), 4228-4237 (2005).
- Padler-Karavani, V., et al. Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: potential implications for disease. Glycobiology. 18 (10), 818-830 (2008).
- Padler-Karavani, V., et al. Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer. Cancer Res. 71 (9), 3352-3363 (2011).
- Cao, H., Chen, X. General consideration on sialic acid chemistry. Methods Mol Biol. 808, 31-56 (2012).
- Deng, L., Chen, X., Varki, A. Exploration of sialic Acid diversity and biology using sialoglycan microarrays. Biopolymers. 99 (10), 650-665 (2013).
- Liang, C. H., Hsu, C. H., Wu, C. Y. Sialoside Arrays: New Synthetic Strategies and Applications. Top Curr Chem. 367, 125-149 (2015).
- Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Smith, D. F., Cummings, R. D. Glycan microarrays of fluorescently-tagged natural glycans. Glycoconj J. 32 (7), 465-473 (2015).
- Muthana, S. M., Gildersleeve, J. C. Glycan microarrays: powerful tools for biomarker discovery. Cancer Biomark. 14 (1), 29-41 (2014).
- Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
- Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F., Cummings, R. D. Preparation and analysis of glycan microarrays. Curr Protoc Protein Sci. 12 (10), (2011).
- Park, S., Gildersleeve, J. C., Blixt, O., Shin, I. Carbohydrate microarrays. Chem Soc Rev. 42 (10), 4310-4326 (2013).
- Struwe, W. B., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: sample preparation guidelines for reliable reporting of glycomics datasets. Glycobiology. 26 (9), 907-910 (2016).
- Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. , (2016).
- Hara, S., Yamaguchi, M., Takemori, Y., Furuhata, K., Ogura, H., Nakamura, M. Determination of mono-O-acetylated N-acetylneuraminic acids in human and rat sera by fluorometric high-performance liquid chromatography. Anal Biochem. 179 (1), 162-166 (1989).
- Padler-Karavani, V., et al. Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays. J Biol Chem. 287 (27), 22593-22608 (2012).
- Padler-Karavani, V., Varki, A. Potential impact of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid on transplant rejection risk. Xenotransplantation. 18 (1), 1-5 (2011).
- Samraj, A. N., et al. A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (2), 542-547 (2015).
- Pearce, O. M., Läubli, H. Sialic acids in cancer biology and immunity. Glycobiology. 26 (2), 111-128 (2016).
- Alisson-Silva, F., Kawanishi, K., Varki, A. Human risk of diseases associated with red meat intake: Analysis of current theories and proposed role for metabolic incorporation of a non-human sialic acid. Mol Aspects Med. 51, 16-30 (2016).
- Pearce, O. M., et al. Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (16), 5998-6003 (2014).
- Pham, T., et al. Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium. Blood. 114 (25), 5225-5235 (2009).
- Reuven, E. M., et al. Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves. Xenotransplantation. 23 (5), 381-392 (2016).
- Ghaderi, D., Taylor, R. E., Padler-Karavani, V., Diaz, S., Varki, A. Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nat Biotechnol. 28 (8), 863-867 (2010).
