Sialoglycanマイクロアレイアッセイによるヒト血清中の抗Neu5Gc IgGのプロファイリング
Summary
シアログリカンマイクロアレイアッセイを用いてヒト血清中の抗Neu5Gc抗体を評価し、癌および他の慢性炎症媒介ヒト疾患のハイスループット診断アッセイを可能にする。
Abstract
細胞は、癌で一般的に変化し、シアル酸（Sia）発現の変化を含む炭水化物鎖（グリカン）の外皮で覆われている。これらは、9炭素骨格を有し、細胞表面上の脊椎動物グリカンをキャップする酸性糖である。哺乳動物の主要な2つのSia型は、 N-アセチルノイラミン酸（Neu5Ac）およびそのヒドロキシル化形態であるN-グリコリルノイラミン酸（Neu5Gc）である。ヒトは、シチジン5 'モノホスフェート-Neu5Ac（CMP-Neu5Ac）ヒドロキシラーゼ（CMAH）をコードする遺伝子の不活性化のために、内因性Neu5Gcを産生することができない。外部Neu5Gcは、赤肉および乳製品の食物摂取を通じてヒト細胞によって獲得され、その後、細胞表面上の多様なグリカンに現れ、主に癌腫に蓄積する。結果として、ヒトは、癌および他の慢性炎症媒介性疾患において多様な役割を果たす循環型抗Neu5Gc抗体を有し、潜在的な診断および治療の可能性になっているラッツ。ここでは、ヒト血清中のそのような抗Neu5Gc抗体を評価するためのハイスループットのシアログリカンマイクロアレイアッセイを記載する。 Neu5Gc含有グリカンおよびそれらの対応する対の対照（Neu5Ac含有グリカン）は、それぞれコア第一アミンを有し、エポキシ被覆ガラススライドに共有結合される。我々は、1プリントあたり最大896個のアレイを生成することができる特定のナノプリンタを用いて、16ウェルフォーマットで56枚のスライドを印刷することを例示する。各スライドを使用して、抗Neu5Gc抗体特異性、強度および多様性の評価のための16の異なるヒト血清サンプルをスクリーニングすることができる。プロトコルは、この堅牢なツールの複雑さを記述し、配列形式で多様な臨床サンプルでNeu5Gc食物炭水化物抗原への応答を調査することを目指しているもののための基本的なガイドラインを提供します。
Introduction
Siasは、脊椎動物の細胞表面糖タンパク質および糖脂質上のグリカン鎖を覆う酸性糖である。 SIA発現は、癌細胞1に変更し、進行および/または転移2,3と相関されます。哺乳類における主要なシアル酸の形の二つはNeu5Acで、そのヒドロキシル形、Neu5Gcを2です。ヒトは、CMAH酵素をコードする遺伝子の特異的不活性化のためにNeu5Gcを合成することができない。この非人間シアル酸は、代謝、食事のNeu5Gcが豊富な食品（ 例えば、赤肉）4、5から「自己」発信されたものとして、人間の細胞に組み込まれています。 Neu5Gcは、ヒト上皮および内皮の細胞表面上に低レベルで存在するが、特に癌腫に蓄積する。 Neu5Gcは、ヒト体液性免疫系2,6によって異物として認識されます。Neu5Gcグリカンの抗原複雑さは、すべての人間6における抗のNeu5Gc抗体応答の複雑さによって反射された、のNeu5Gc修正、結合、基礎となるグリカン及び足場、およびそれらの濃度を含む複数のレベルで生じ得ます。これらの抗体の一部は、癌腫バイオマーカーおよび潜在的な免疫療法剤として役立つ7 。異なるsialoglycans 8の化学酵素合成の出現は、グリカンマイクロアレイ技術9、10の使用によって容易にそのような抗体のより詳細な分析のために道を開きました。このように、天然および合成炭水化物の大きなライブラリーの促進準備と操作で、グリカンマイクロアレイは、生体分子10、11の無数と炭水化物の相互作用を調査するための強力なハイスループット技術となっています</sup> 12、13。アレイ形式では、最小限の量の材料が使用され、生物学的に関連するグリカンのこの多価ディスプレイは、単一の実験において数千の結合相互作用の調査を可能にする。重要なことは、この技術はまた、バイオマーカー探索へと様々なサンプル7、12で免疫応答をモニタリングに適用することができます。
成功したグリカンマイクロアレイ作製には、プリンターロボットタイプ、グリカンコンジュゲーション化学、および検出光学系という3つの重要な側面を考慮する必要があります。印刷装置の考察に関しては、接触型および非接触型の2つの技術が利用可能である。接触印刷では、1〜48個のスチールピンを、グリカン溶液を含むマルチウエル源プレートに浸漬し、ガラススライド表面に直接接触させることにより官能化ガラススライド上にスポットする。解の量deスライドに生きているのは、スライド表面上の持続時間の関数である。通常、試料はスライド表面に印刷される前にガラスブロック上に先ず予めスポットされ（均質なスポットに到達する）。非接触プリンタ（ 例えば、圧電式プリンタ）では、制御された電気信号を用いてグリカンをガラスキャピラリから印刷する。電気信号は、接触印刷に比べてより正確な印刷を達成するために細かく較正することができる。スポットのサイズおよび形態も比較的均一である。さらなる利点は、印刷後にサンプルをソースプレートに再循環させることである。それにもかかわらず、ピエゾ電子式プリンタの主な欠点は、印刷チップの制限（4または8）であり、スライドの安定性、温度、湿度およびサンプルの蒸発に特に注意する必要がある非常に長い印刷時間をもたらす。非接触型インクジェットプリンタは、より大きなサンプル体積14を必要とする。
<p class = "jove_content">印刷法の利用可能なオプションが限られているのに対して、グリカン結合化学はより複雑な選択肢であり、選択肢は数多くあります。選択された固定化化学は、グリカン上の活性基および摺動表面反応性の両方を考慮しなければならない。特定のマイクロアレイ表面上に固定化されるグリカンは、合成的に合成されるかまたは天然に単離されるかのいずれも、同一の反応基を必要とする。さらに、グリカンは純粋で均質である必要があります。一方、固定化表面および化学物質は、再現性および信頼性のある付着密度を提供すべきである。複数の固定化方法は、共有結合または非共有結合（物理吸着）アタッチメント10、11、12、13のいずれかを用いて開発されてきました。 Uninitiateのための印刷されたグリカンマイクロアレイ技術に関する詳細な情報についてはDの研究者は、これらの優れたレビューは13、15を参照してください。重要なのは、グライコミクス実験（MIRAGE）イニシアチブのための最近の最低限必要な情報は、サンプル調製16のためにと、この成長分野で基準を改善するために17を解析し、糖鎖マイクロアレイからのデータを報告するためのガイドラインを説明します。ここでは、特定の接触ナノプリンターを用いて16ウェルフォーマットでシアログリカンマイクロアレイを作製するための詳細なプロトコールについて説明する。各グリカンは、エポキシ活性化ガラススライドへのそれらの共有結合を媒介する第一級アミンを有する。我々はまた、様々なヒト血清サンプル、抗体、およびSia結合性植物レクチンを用いた1つのスライドの開発および分析について記載する。 Sialoglycanマイクロアレイアッセイは、アレイ作製、プロセシング、展開、および分析を含むいくつかの主要なステップを含む。アレイの製造には、arグリカンおよびソースプレートの準備、ナノプリンターのプログラミング、およびスライドの印刷を行うことができます。続いて、スライドを処理し、開発し、分析する（ 図1 ）。
Protocol
Representative Results
Discussion
成功したグリカンマイクロアレイ作製には注意深い計画が必要であり、プロトコルにいくつかの重要なステップが含まれています。これらは、（1）すべての後続のパラメータ（ 例えば、距離、間隔、サンプルの量、および印刷）を定義ブロックおよびプレートのレイアウトを計画します。 （2）ピンの清掃およびピンの完全性の確保。これはスポットの均質性を制御するために重要で…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、イスラエル癌研究基金のResearch Career Development Award、Israeli National Nanotechnology Initiativeの助成金、Personalized Theranostics（VP-K）のNanomedicinesに関するFocal Technology AreaのHelmsley Charitable Trust、およびNational健康教育機関R01GM076360（XCへ）。
Materials
| Primary-amine containing sialoglycans | Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services) | Contact info@glycohubusa.com for compound requests | Printed glycans |
| Monosodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | Printing buffer component |
| Disodium phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | Printing buffer component |
| Phosphate buffered saline | Hy-Labs | BP-507/500D | Printing buffer/ incubation/washing buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Slide blocking reagent |
| Glycerol | Sigma | G-7893 | Printing buffer component |
| Ethanolamine | Thermo-Fisher Scientific | 0700/08 | Slide blocking reagent |
| Ovalbumin (Grade V) | Sigma | A5503 | Slide Blocking protein |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | Slide washing detergent |
| Alexa 555-Hydrazide | Thermo-Fisher Scientific | A20501MP | Marker on array |
| ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Printing component |
| Biotinylated- SNA | Vector Laboratories | B-1305 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–6-linked |
| Biotinylated-MALII | Vector Laboratories | B-1265 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–3-linked |
| Chicken-anti Neu5Gc IgY | BioLegend | 146903 | Primary detection |
| Cy3-Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-0848 | Biotin binding |
| Cy3-anti Human IgG | Jackson Immunoresearch | 109-165-088 | Secondary detection against human IgG |
| Cy3-anti Chicken IgY | Jackson Immunoresearch | 703-165-155 | Secondary detection against chicken IgY |
| Human sera samples | Israeli Blood Bank | Primary detection | |
| Compressed Nitrogen (Grade 5) | General dusting/drying tool | ||
| Epoxy-coated slides | Corning | 40044 | Slides |
| Epoxy-coated slides | PolyAn | 2D 104-00-221 | Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 µm size spots. |
| 384-well microtiter plate | Genetix | 2070 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-310 | Slide labeling |
| Staining Tube | ArrayIt | MST | Slide developing tool |
| Staining bath | VWR | 25608-904 | Slide developing tool |
| Slides glass holders | VWR | 631-9321 | Slide developing tool |
| GenePix Scanner | Molecular devices | 4000B | Slide scanner |
| LM-60 NanoPrinter | ArrayIt | LM-60 | Array printer |
| Pins | ArrayIt | 946MP3 | Printing pins |
| ProPlate Module | Grace Bio-Labs | P37004 | Slide developing module |
| Distilled water | Bio-Lab | 2321020500 | Required for arrayer and humidifier |
| Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 μL | Thermo-Fisher Scientific (Matrix) | MA-2131 Impact2 Equalizer 384 | Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate |
References
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