Profiling Anti-Neu5Gc IgG i Human Sera med Sialoglycan Microarray Assay
Summary
En sialoglykan-mikroarray-analyse kan brukes til å evaluere anti-Neu5Gc-antistoffer i humane sera, noe som gjør den til en potensiell diagnostisk analyse med høy gjennomstrømning for kreft og andre kroniske betennelsesfremmende menneskelige sykdommer.
Abstract
Celler er dekket med kapp av karbohydratkjeder (glykaner) som ofte endres i kreft, og som inkluderer variasjoner i sialinsyre (Sia) -uttrykk. Disse er sure sukker som har en 9-karbon ryggrad og det hekker vertebrat glykaner på celleoverflater. To av de viktigste Sia-formene i pattedyr er N- acetylneuraminsyre (Neu5Ac) og dets hydroksylerte form, N- glykylylururaminsyre (Neu5Gc). Mennesker kan ikke produsere endogen Neu5Gc på grunn av inaktivering av genet som koder for cytidin 5'monofosfat-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hydroksylase (CMAH). Utenlandsk Neu5Gc er kjøpt av menneskelige celler gjennom kostholdet av rødt kjøtt og meieri og vises senere på ulike glykaner på celleoverflaten, som hovedsakelig akkumuleres på karcinomer. Følgelig har mennesker sirkulerende anti-Neu5Gc-antistoffer som spiller ulike roller i kreft og andre kroniske betennelsemidlede sykdommer, og som blir potensielle diagnostiske og terapeutiske targets. Her beskriver vi en high-throughput sialoglycan microarray assay for å vurdere slike anti-Neu5Gc antistoffer i humane sera. Neu5Gc-holdige glykaner og deres matchede par av kontroller (Neu5Ac-holdige glykaner), hver med en kjernemessig primær amin, er kovalent bundet til epoksybelagte glassruter. Vi eksemplifiserer utskrift av 56 lysbilder i 16-brønnformat ved hjelp av en bestemt nanoprinter som kan generere opptil 896 arrayer per utskrift. Hvert lysbilde kan brukes til å skjerme 16 forskjellige humane serumprøver for evaluering av anti-Neu5Gc-antistoff-spesifisitet, intensitet og mangfold. Protokollen beskriver kompleksiteten til dette robuste verktøyet og gir en grunnleggende retningslinje for dem som har som mål å undersøke svaret på Neu5Gc diettkarbohydratantigen i ulike kliniske prøver i et arrayformat.
Introduction
Sias er sure sukker som dekker glykankjeder på celleoverflate glykoproteiner og glykolipider hos vertebrater. Sia-ekspresjon er modifisert i kreftceller 1 og korrelerer med progresjon og / eller metastase 2 , 3 . To av de viktigste Sia-formene i pattedyr er Neu5Ac og dets hydroksylerte form, Neu5Gc 2 . Mennesker kan ikke syntetisere Neu5Gc på grunn av en spesifikk inaktivering av genet som koder for CMAH-enzymet. Denne ikke-humane Sia inkorporerer metabolisk i menneskelige celler som "selv", som stammer fra kostholdige Neu5Gc-rike matvarer ( f.eks. Rødt kjøtt) 4 , 5 . Neu5Gc er tilstede i lave nivåer på celleoverflatene av human epithelia og endothelia, men det akkumuleres spesielt i karcinomer. Neu5Gc er anerkjent som fremmed av humant humoral immune system 2 , 6 .Den antigene kompleksiteten av Neu5Gc-glykaner kan oppstå på flere nivåer, inkludert Neu5Gc modifisering, binding, underliggende glykaner og stillaser, og deres tetthet, alt reflektert av kompleksiteten av anti-Neu5Gc antistoffrespons hos mennesker 6 . Noen av disse antistoffene fungerer som karsinombiomarkører og potensielle immunoterapeutiske midler 7 . Tilkomsten av den kjemoenzymatiske syntesen av forskjellige sialoglykaner 8 banet vei for en mer grundig analyse av slike antistoffer, lettet ved bruk av glykansk mikroarray teknologi 9 , 10 . Således, med den enkle forberedelsen og manipuleringen av store biblioteker av naturlige og syntetiske karbohydrater, har glykanmikroarrays blitt en kraftig høy-throughput-teknologi for å undersøke samspillet mellom karbohydrater med et myriade av biomolekyler 10 , 11 , </sup> 12 , 13 . I et arrayformat blir det brukt små mengder materialer, og denne multivalente visning av biologisk relevante glykaner tillater undersøkelse av tusenvis av bindende interaksjoner i et enkelt eksperiment. Det er viktig at denne teknologien også kan brukes til biomarkørfunn og for å overvåke immunrespons i ulike prøver 7 , 12 .
Vellykket glykan mikroarray-fabrikasjon krever behandling av tre viktige aspekter: skriverrobotypen, glykan-konjugasjonskjemien og deteksjonsoptikk. Når det gjelder utskriftinstrumentet, er det to teknikker tilgjengelig: kontakt- og ikke-kontaktprintere. Ved kontaktutskrift dyppes 1-48 stålpinner i en multi-brønn kildeplate som inneholder glykanoppløsning og er oppdaget på funksjonsglassplater ved direkte å kontakte glassglassoverflaten. Løsningen er deLeveret til lysbildet er en funksjon av den lengende varigheten på lysbildeoverflaten. Vanligvis blir prøvene først forhåndsplettet på en glassblokk (for å nå homogene punkter) før de skrives ut på glidoverflaten. I ikke-kontakt skrivere ( f.eks. Piezo-elektroniske skriveren), skrives glykansene fra en glasskapillær ved hjelp av kontrollerte elektriske signaler. Det elektriske signalet kan finjusteres for å oppnå mer presis utskrift i forhold til kontaktutskrift. Plassens størrelse og morfologi er også relativt mer homogene. En ekstra fordel er gjenvinningen av prøven tilbake til kildeplaten etter utskrift. Ikke desto mindre er den største ulempen ved piezo-elektroniske skrivere trykkbegrensningsbegrensningen (4 eller 8), noe som resulterer i en meget lang utskriftstid, noe som krever spesiell oppmerksomhet til glidestabilitet, temperatur, fuktighet og prøvefordampning. Inkjet-skriveren uten kontakt krever større prøvevolumer 14 .
<p class = "jove_content"> I motsetning til de begrensede tilgjengelige alternativene for utskriftsmetoder, er glykan-konjugasjonskemi en mer kompleks overveielse, med mange muligheter å velge mellom. Utvalgt immobiliseringskemi må utgjøre både de aktive gruppene på glykaner og glidoverflatenes reaktivitet. Glykaner som skal immobiliseres på en bestemt mikroarrayoverflate, enten syntetisk syntetisert eller naturlig isolert, krever alle en identisk reaktiv gruppe. I tillegg må glykanene være rene og homogene. På den annen side skal immobiliseringsoverflaten og kjemi gi reproduserbarhet og pålitelig fasthetsdensitet. Flere immobiliseringsmetoder er blitt utviklet med enten kovalent eller ikke-kovalent (fysisk absorpsjon) vedlegg 10 , 11 , 12 , 13 . For svært detaljert informasjon om trykt glykan microarray teknologi for uninitiateD-undersøker, referer til disse gode anmeldelser 13 , 15 . Viktig er at den nyeste Minimumsinformasjon som kreves for et Glycomics Experiment (MIRAGE) -initiativ, beskriver retningslinjer for prøvepreparasjon 16 og for rapportering av data fra glykanmikarrayanalyser 17 for å forbedre standardene i dette voksende feltet.Her beskriver vi en detaljert protokoll for fremstilling av sialoglycan mikroarrays ved hjelp av en bestemt kontakt nano-skriver i 16-brønnformat. Hver av glykansene har en primær amin som formidler sin kovalente kobling til epoksyaktiverte glassglass. Vi beskriver også utviklingen og analysen av ett lysbilde ved bruk av forskjellige humane seraprøver, antistoffer og Sia-bindende plantelektiner. Sialoglycan microarray analyser innebærer flere hovedtrinn som inkluderer array fabrikasjon, behandling, utvikling og analyse. Array fabrication krever planlegging av arRay-layout, forbereder glykaner og kildeplate, programmerer nano-skriveren og skriver ut lysbildene. Deretter behandles, utvikles og analyseres lysbildene ( figur 1 ).
Protocol
Representative Results
Discussion
En vellykket glycan microarray-fabrikasjon krever nøye planlegging og inneholder flere viktige trinn i protokollen. Disse inkluderer: (1) planlegging av blokk- og plateoppsett som definerer alle etterfølgende parametere ( f.eks. Avstander, avstand, mengde prøver og utskrift); (2) rengjøring av pinnene og sikring av pin integritet, noe som er kritisk for å kontrollere spot homogenitet; (3) opprettholder høy luftfuktighet under utskrift, kritisk for å unngå prøvefordampning under lange utskrifter, noe so…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble delvis støttet av en forskningskarriereutviklingstildeling fra Israels forskningsfond, et tilskudd fra det israelske nasjonale nanoteknologiinitiativet og Helmsley Charitable Trust for et fokalt teknologisk område for nanomedisiner for personlig terapeutisk medisin (VP-K) og nasjonalt Institutt for helse tilskudd R01GM076360 (til XC).
Materials
| Primary-amine containing sialoglycans | Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services) | Contact info@glycohubusa.com for compound requests | Printed glycans |
| Monosodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | Printing buffer component |
| Disodium phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | Printing buffer component |
| Phosphate buffered saline | Hy-Labs | BP-507/500D | Printing buffer/ incubation/washing buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Slide blocking reagent |
| Glycerol | Sigma | G-7893 | Printing buffer component |
| Ethanolamine | Thermo-Fisher Scientific | 0700/08 | Slide blocking reagent |
| Ovalbumin (Grade V) | Sigma | A5503 | Slide Blocking protein |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | Slide washing detergent |
| Alexa 555-Hydrazide | Thermo-Fisher Scientific | A20501MP | Marker on array |
| ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Printing component |
| Biotinylated- SNA | Vector Laboratories | B-1305 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–6-linked |
| Biotinylated-MALII | Vector Laboratories | B-1265 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–3-linked |
| Chicken-anti Neu5Gc IgY | BioLegend | 146903 | Primary detection |
| Cy3-Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-0848 | Biotin binding |
| Cy3-anti Human IgG | Jackson Immunoresearch | 109-165-088 | Secondary detection against human IgG |
| Cy3-anti Chicken IgY | Jackson Immunoresearch | 703-165-155 | Secondary detection against chicken IgY |
| Human sera samples | Israeli Blood Bank | Primary detection | |
| Compressed Nitrogen (Grade 5) | General dusting/drying tool | ||
| Epoxy-coated slides | Corning | 40044 | Slides |
| Epoxy-coated slides | PolyAn | 2D 104-00-221 | Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 µm size spots. |
| 384-well microtiter plate | Genetix | 2070 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-310 | Slide labeling |
| Staining Tube | ArrayIt | MST | Slide developing tool |
| Staining bath | VWR | 25608-904 | Slide developing tool |
| Slides glass holders | VWR | 631-9321 | Slide developing tool |
| GenePix Scanner | Molecular devices | 4000B | Slide scanner |
| LM-60 NanoPrinter | ArrayIt | LM-60 | Array printer |
| Pins | ArrayIt | 946MP3 | Printing pins |
| ProPlate Module | Grace Bio-Labs | P37004 | Slide developing module |
| Distilled water | Bio-Lab | 2321020500 | Required for arrayer and humidifier |
| Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 μL | Thermo-Fisher Scientific (Matrix) | MA-2131 Impact2 Equalizer 384 | Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate |
References
- Padler-Karavani, V. Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine. Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).
- Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye, ., Padler-Karavani, S., V, Glycans in immune recognition and response. Carbohydr Res. 389, 115-122 (2014).
- Häuselmann, I., Borsig, L. Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis. Front Oncol. 4, (2014).
- Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (21), 12045-12050 (2003).
- Bardor, M., Nguyen, D. H., Diaz, S., Varki, A. Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells. J Biol Chem. 280 (6), 4228-4237 (2005).
- Padler-Karavani, V., et al. Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: potential implications for disease. Glycobiology. 18 (10), 818-830 (2008).
- Padler-Karavani, V., et al. Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer. Cancer Res. 71 (9), 3352-3363 (2011).
- Cao, H., Chen, X. General consideration on sialic acid chemistry. Methods Mol Biol. 808, 31-56 (2012).
- Deng, L., Chen, X., Varki, A. Exploration of sialic Acid diversity and biology using sialoglycan microarrays. Biopolymers. 99 (10), 650-665 (2013).
- Liang, C. H., Hsu, C. H., Wu, C. Y. Sialoside Arrays: New Synthetic Strategies and Applications. Top Curr Chem. 367, 125-149 (2015).
- Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Smith, D. F., Cummings, R. D. Glycan microarrays of fluorescently-tagged natural glycans. Glycoconj J. 32 (7), 465-473 (2015).
- Muthana, S. M., Gildersleeve, J. C. Glycan microarrays: powerful tools for biomarker discovery. Cancer Biomark. 14 (1), 29-41 (2014).
- Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
- Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F., Cummings, R. D. Preparation and analysis of glycan microarrays. Curr Protoc Protein Sci. 12 (10), (2011).
- Park, S., Gildersleeve, J. C., Blixt, O., Shin, I. Carbohydrate microarrays. Chem Soc Rev. 42 (10), 4310-4326 (2013).
- Struwe, W. B., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: sample preparation guidelines for reliable reporting of glycomics datasets. Glycobiology. 26 (9), 907-910 (2016).
- Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. , (2016).
- Hara, S., Yamaguchi, M., Takemori, Y., Furuhata, K., Ogura, H., Nakamura, M. Determination of mono-O-acetylated N-acetylneuraminic acids in human and rat sera by fluorometric high-performance liquid chromatography. Anal Biochem. 179 (1), 162-166 (1989).
- Padler-Karavani, V., et al. Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays. J Biol Chem. 287 (27), 22593-22608 (2012).
- Padler-Karavani, V., Varki, A. Potential impact of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid on transplant rejection risk. Xenotransplantation. 18 (1), 1-5 (2011).
- Samraj, A. N., et al. A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (2), 542-547 (2015).
- Pearce, O. M., Läubli, H. Sialic acids in cancer biology and immunity. Glycobiology. 26 (2), 111-128 (2016).
- Alisson-Silva, F., Kawanishi, K., Varki, A. Human risk of diseases associated with red meat intake: Analysis of current theories and proposed role for metabolic incorporation of a non-human sialic acid. Mol Aspects Med. 51, 16-30 (2016).
- Pearce, O. M., et al. Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (16), 5998-6003 (2014).
- Pham, T., et al. Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium. Blood. 114 (25), 5225-5235 (2009).
- Reuven, E. M., et al. Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves. Xenotransplantation. 23 (5), 381-392 (2016).
- Ghaderi, D., Taylor, R. E., Padler-Karavani, V., Diaz, S., Varki, A. Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nat Biotechnol. 28 (8), 863-867 (2010).
