Профилирование IgG против Neu5Gc в человеческой сыворотке с помощью анализа сиалогликанового микрочипа
Summary
Анализ с использованием сиалогликана для микрочипов может быть использован для оценки антител против Neu5Gc в сыворотке крови человека, что делает его потенциальным высокопроизводительным диагностическим анализом рака и других хронических заболеваний, опосредованных воспалением.
Abstract
Клетки покрыты плащей углеводных цепей (гликанов), которые обычно изменяются при раке, и которые включают изменения экспрессии сиаловой кислоты (Sia). Это кислые сахара, которые имеют 9-углеродный скелет и эти крысиные позвоночные гликаны на поверхности клеток. Двумя основными формами Sia у млекопитающих являются N- ацетилнейраминовая кислота (Neu5Ac) и ее гидроксилированная форма, N- гликолилнейраминовая кислота (Neu5Gc). Люди не могут продуцировать эндогенный Neu5Gc из-за инактивации гена, кодирующего гидроксилазу Cytidine 5'монофосфата-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) (CMAH). Иностранный Neu5Gc приобретается клетками человека через диетическое потребление красного мяса и молочных продуктов и впоследствии появляется на разных гликанах на поверхности клеток, накапливаясь в основном на карциномах. Следовательно, люди имеют циркулирующие антитела против Neu5Gc, которые играют разнообразную роль в раке и других хронических заболеваниях, опосредуемых воспалением, и которые становятся потенциальными диагностическими и терапевтическимиrgets. Здесь мы описываем высокопрочный сиалогликанный микрочиповый анализ для оценки таких антител против Neu5Gc в сыворотке крови человека. Глюканы, содержащие Neu5Gc, и их согласованные пары контролей (гель-гены, содержащие Neu5Ac), каждый с основным первичным амином, ковалентно связаны с стеклянными слайдами с эпоксидным покрытием. Мы демонстрируем печать 56 слайдов в 16-луночном формате с использованием конкретного нано-принтера, способного генерировать до 896 массивов на печать. Каждый слайд может использоваться для скрининга 16 различных образцов сыворотки человека для оценки специфичности, интенсивности и разнообразия антител против Neu5Gc. Протокол описывает сложность этого надежного инструмента и дает основное руководство для тех, кто стремится исследовать реакцию на диетический углеводный антиген Neu5Gc в различных клинических образцах в формате массива.
Introduction
Sias – кислые сахара, покрывающие гликановые цепи на гликопротеинах клеточной поверхности и гликолипидах у позвоночных. Экспрессия Sia модифицируется в раковых клетках 1 и коррелирует с прогрессированием и / или метастазами 2 , 3 . Двумя основными формами Sia у млекопитающих являются Neu5Ac и его гидроксилированная форма Neu5Gc 2 . Люди не могут синтезировать Neu5Gc из-за специфической инактивации гена, кодирующего фермент CMAH. Этот нечеловеческий Sia метаболически включает в клетки человека как «я», происходящие из диетических продуктов, богатых Neu5Gc ( например, красного мяса) 4 , 5 . Neu5Gc присутствует на низких уровнях на клеточных поверхностях эпителия человека и эндотелии, но он особенно накапливается в карциномах. Neu5Gc признан чужеродным гуморальной иммунной системой человека 2 , 6 .Антигенная сложность Neu5Gc-гликанов может возникать на нескольких уровнях, включая модификацию Neu5Gc, связывание, лежащие в основе гликаны и каркасы, и их плотность, что отражается на сложности ответа антитела против Neu5Gc у людей 6 . Некоторые из этих антител являются биомаркерами карциномы и потенциальными иммунотерапевтическими средствами 7 . Появление химиоферментального синтеза различных сиалогликанов 8 способствовало более глубокому анализу таких антител, чему способствовало использование технологии микрочипов гликана 9 , 10 . Таким образом, благодаря облегченной подготовке и манипулированию большими библиотеками природных и синтетических углеводов глианные микрочипы стали мощной высокопроизводительной технологией для исследования взаимодействия углеводов с множеством биомолекул 10 , 11 , </sup> 12 , 13 . В формате массива используются минимальные количества материалов, и этот многовалентный дисплей биологически релевантных гликанов позволяет исследовать тысячи связывающих взаимодействий в одном эксперименте. Важно отметить, что эта технология также может быть применена к обнаружению биомаркеров и для мониторинга иммунных ответов в различных образцах 7 , 12 .
Успешное изготовление микрочипов в гликанах требует рассмотрения трех важных аспектов: типа робота-принтера, химии конъюгации гликанов и оптики обнаружения. Что касается рассмотрения печатного инструмента, доступны два метода: контактные и бесконтактные принтеры. При контактной печати 1-48 стальных штифтов погружают в пластину с множеством колодцев, содержащую раствор гликанов, и высевают на функционализированные стеклянные слайды, непосредственно контактируя с поверхностью стекла. Сумма решения deСжиженный на слайде, является функцией продолжительной продолжительности на поверхности скольжения. Обычно образцы сначала предварительно фиксируются на стеклянном блоке (чтобы достичь однородных пятен), прежде чем они будут напечатаны на поверхности скольжения. В бесконтактных принтерах ( например, пьезоэлектронный принтер) гликаны печатаются из стеклянного капилляра с использованием контролируемых электрических сигналов. Электрический сигнал может быть точно калиброван для достижения более точной печати относительно контактной печати. Размер и морфология пятен также относительно более однородны. Дополнительным преимуществом является повторная рециркуляция образца обратно к исходной пластине после печати. Тем не менее, основным недостатком пьезоэлектронных принтеров является ограничение на печать (4 или 8), что приводит к очень длительной длительности печати, что требует особого внимания стабильности скольжения, температуры, влажности и испарения образца. Бесконтактный струйный принтер требует больших объемов выборки 14 .
<p class = "jove_content"> В отличие от ограниченных доступных вариантов методов печати, химия конъюгации гликанов является более сложным соображением, с множеством вариантов на выбор. Отобранная химия иммобилизации должна учитывать как активные группы на гликанах, так и реактивность поверхности скольжения. Гликаны, которые должны быть иммобилизованы на определенную поверхность микрочипа, синтетически синтезированную или естественно изолированную, требуют одинаковой реактивной группы. Кроме того, гликаны должны быть чистыми и гомогенными. С другой стороны, поверхность иммобилизации и химия должны обеспечивать воспроизводимость и надежную плотность крепления. Были разработаны множественные методы иммобилизации с использованием ковалентного или нековалентного (физического поглощения) 10 , 11 , 12 , 13 . Для получения более подробной информации о печатной технологии микрочипов гликана для непосвященныхD следователь, см. Эти превосходные обзоры 13 , 15 . Важно отметить, что недавняя минимальная информация, необходимая для инициативы Glycomics Experiment (MIRAGE), описывает руководящие принципы для подготовки образцов 16 и для представления данных из анализа микрочипов гликана 17 для улучшения стандартов в этой растущей области.Здесь мы опишем подробный протокол для изготовления микромассивов сиалогликана с использованием специального контактного нанопринтера в формате с 16 ячейками. Каждый из гликанов имеет первичный амин, который опосредует их ковалентную связь с стеклами, активированными эпоксидным стеклом. Мы также описываем разработку и анализ одного слайда с использованием различных образцов сыворотки крови, антител и лектинов, связывающих Sia-связывание. Анализы микроматрицы Sialoglycan включают в себя несколько основных этапов, которые включают в себя изготовление, обработку, разработку и анализ массивов. Изготовление массивов требует планированияЛучевой макет, подготовка гликанов и исходной пластины, программирование нано-принтера и печать слайдов. Затем слайды обрабатываются, разрабатываются и анализируются ( рис. 1 ).
Protocol
Representative Results
Discussion
Успешное изготовление микрочипов из гликана требует тщательного планирования и включает несколько важных шагов в протоколе. К ним относятся: (1) планирование макетов блоков и таблиц, которые определяют все последующие параметры ( например, расстояния, расстояние, количество выбор…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана премией за исследования в области развития карьеры в Израиле от Фонда исследований рака Израиля, грантом от израильской национальной инициативы по нанотехнологиям и благотворительным фондом Хелмсли в области фокусных технологий на наномицинах для персонализированных терапевтических средств (VP-K) и национальной Институты здравоохранения грант R01GM076360 (до XC).
Materials
| Primary-amine containing sialoglycans | Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services) | Contact info@glycohubusa.com for compound requests | Printed glycans |
| Monosodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | Printing buffer component |
| Disodium phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | Printing buffer component |
| Phosphate buffered saline | Hy-Labs | BP-507/500D | Printing buffer/ incubation/washing buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Slide blocking reagent |
| Glycerol | Sigma | G-7893 | Printing buffer component |
| Ethanolamine | Thermo-Fisher Scientific | 0700/08 | Slide blocking reagent |
| Ovalbumin (Grade V) | Sigma | A5503 | Slide Blocking protein |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | Slide washing detergent |
| Alexa 555-Hydrazide | Thermo-Fisher Scientific | A20501MP | Marker on array |
| ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Printing component |
| Biotinylated- SNA | Vector Laboratories | B-1305 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–6-linked |
| Biotinylated-MALII | Vector Laboratories | B-1265 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–3-linked |
| Chicken-anti Neu5Gc IgY | BioLegend | 146903 | Primary detection |
| Cy3-Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-0848 | Biotin binding |
| Cy3-anti Human IgG | Jackson Immunoresearch | 109-165-088 | Secondary detection against human IgG |
| Cy3-anti Chicken IgY | Jackson Immunoresearch | 703-165-155 | Secondary detection against chicken IgY |
| Human sera samples | Israeli Blood Bank | Primary detection | |
| Compressed Nitrogen (Grade 5) | General dusting/drying tool | ||
| Epoxy-coated slides | Corning | 40044 | Slides |
| Epoxy-coated slides | PolyAn | 2D 104-00-221 | Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 µm size spots. |
| 384-well microtiter plate | Genetix | 2070 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-310 | Slide labeling |
| Staining Tube | ArrayIt | MST | Slide developing tool |
| Staining bath | VWR | 25608-904 | Slide developing tool |
| Slides glass holders | VWR | 631-9321 | Slide developing tool |
| GenePix Scanner | Molecular devices | 4000B | Slide scanner |
| LM-60 NanoPrinter | ArrayIt | LM-60 | Array printer |
| Pins | ArrayIt | 946MP3 | Printing pins |
| ProPlate Module | Grace Bio-Labs | P37004 | Slide developing module |
| Distilled water | Bio-Lab | 2321020500 | Required for arrayer and humidifier |
| Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 μL | Thermo-Fisher Scientific (Matrix) | MA-2131 Impact2 Equalizer 384 | Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate |
References
- Padler-Karavani, V. Aiming at the sweet side of cancer: Aberrant glycosylation as possible target for personalized-medicine. Cancer Lett. 352 (1), 102-112 (2014).
- Amon, R., Reuven, E. M., Leviatan Ben-Arye, ., Padler-Karavani, S., V, Glycans in immune recognition and response. Carbohydr Res. 389, 115-122 (2014).
- Häuselmann, I., Borsig, L. Altered tumor-cell glycosylation promotes metastasis. Front Oncol. 4, (2014).
- Tangvoranuntakul, P., et al. Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (21), 12045-12050 (2003).
- Bardor, M., Nguyen, D. H., Diaz, S., Varki, A. Mechanism of uptake and incorporation of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid into human cells. J Biol Chem. 280 (6), 4228-4237 (2005).
- Padler-Karavani, V., et al. Diversity in specificity, abundance, and composition of anti-Neu5Gc antibodies in normal humans: potential implications for disease. Glycobiology. 18 (10), 818-830 (2008).
- Padler-Karavani, V., et al. Human xeno-autoantibodies against a non-human sialic acid serve as novel serum biomarkers and immunotherapeutics in cancer. Cancer Res. 71 (9), 3352-3363 (2011).
- Cao, H., Chen, X. General consideration on sialic acid chemistry. Methods Mol Biol. 808, 31-56 (2012).
- Deng, L., Chen, X., Varki, A. Exploration of sialic Acid diversity and biology using sialoglycan microarrays. Biopolymers. 99 (10), 650-665 (2013).
- Liang, C. H., Hsu, C. H., Wu, C. Y. Sialoside Arrays: New Synthetic Strategies and Applications. Top Curr Chem. 367, 125-149 (2015).
- Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Smith, D. F., Cummings, R. D. Glycan microarrays of fluorescently-tagged natural glycans. Glycoconj J. 32 (7), 465-473 (2015).
- Muthana, S. M., Gildersleeve, J. C. Glycan microarrays: powerful tools for biomarker discovery. Cancer Biomark. 14 (1), 29-41 (2014).
- Rillahan, C. D., Paulson, J. C. Glycan microarrays for decoding the glycome. Annu Rev Biochem. 80, 797-823 (2011).
- Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F., Cummings, R. D. Preparation and analysis of glycan microarrays. Curr Protoc Protein Sci. 12 (10), (2011).
- Park, S., Gildersleeve, J. C., Blixt, O., Shin, I. Carbohydrate microarrays. Chem Soc Rev. 42 (10), 4310-4326 (2013).
- Struwe, W. B., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: sample preparation guidelines for reliable reporting of glycomics datasets. Glycobiology. 26 (9), 907-910 (2016).
- Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. , (2016).
- Hara, S., Yamaguchi, M., Takemori, Y., Furuhata, K., Ogura, H., Nakamura, M. Determination of mono-O-acetylated N-acetylneuraminic acids in human and rat sera by fluorometric high-performance liquid chromatography. Anal Biochem. 179 (1), 162-166 (1989).
- Padler-Karavani, V., et al. Cross-comparison of protein recognition of sialic acid diversity on two novel sialoglycan microarrays. J Biol Chem. 287 (27), 22593-22608 (2012).
- Padler-Karavani, V., Varki, A. Potential impact of the non-human sialic acid N-glycolylneuraminic acid on transplant rejection risk. Xenotransplantation. 18 (1), 1-5 (2011).
- Samraj, A. N., et al. A red meat-derived glycan promotes inflammation and cancer progression. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (2), 542-547 (2015).
- Pearce, O. M., Läubli, H. Sialic acids in cancer biology and immunity. Glycobiology. 26 (2), 111-128 (2016).
- Alisson-Silva, F., Kawanishi, K., Varki, A. Human risk of diseases associated with red meat intake: Analysis of current theories and proposed role for metabolic incorporation of a non-human sialic acid. Mol Aspects Med. 51, 16-30 (2016).
- Pearce, O. M., et al. Inverse hormesis of cancer growth mediated by narrow ranges of tumor-directed antibodies. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (16), 5998-6003 (2014).
- Pham, T., et al. Evidence for a novel human-specific xeno-auto-antibody response against vascular endothelium. Blood. 114 (25), 5225-5235 (2009).
- Reuven, E. M., et al. Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves. Xenotransplantation. 23 (5), 381-392 (2016).
- Ghaderi, D., Taylor, R. E., Padler-Karavani, V., Diaz, S., Varki, A. Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nat Biotechnol. 28 (8), 863-867 (2010).
