Perfilación de IgG anti-Neu5Gc en sueros humanos con un ensayo de microarray de sialoglucano
Summary
Se puede utilizar un ensayo de microarrays de sialoglucano para evaluar anticuerpos anti-Neu5Gc en sueros humanos, lo que lo convierte en un posible ensayo diagnóstico de alto rendimiento para el cáncer y otras enfermedades humanas mediadas por inflamación crónica.
Abstract
Las células están cubiertas con un manto de cadenas de carbohidratos (glicanos) que se altera habitualmente en el cáncer y que incluye variaciones en la expresión del ácido siálico (Sia). Se trata de azúcares ácidos que tienen una cadena principal de 9 carbonos y que tapan los glicanos vertebrados en las superficies celulares. Dos de las principales formas de Sia en los mamíferos son el ácido N- acetilneuramínico (Neu5Ac) y su forma hidroxilada, el ácido N- glicolilneuramínico (Neu5Gc). Los seres humanos no pueden producir Neu5Gc endógeno debido a la inactivación del gen que codifica la citidina 5'monofosfato-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) hidroxilasa (CMAH). Neu5Gc extranjero es adquirido por las células humanas a través del consumo de la dieta de la carne roja y lácteos y posteriormente aparece en diversos glicanos en la superficie celular, acumulando principalmente en carcinomas. En consecuencia, los seres humanos tienen anticuerpos circulantes anti-Neu5Gc que desempeñan diversos papeles en el cáncer y otras enfermedades crónicas mediadas por la inflamación y que se están convirtiendo en potencial diagnóstico y terapéutico.Rgets Aquí, se describe un alto rendimiento sialoglycan microarray ensayo para evaluar tales anticuerpos anti-Neu5Gc en el suero humano. Los glicanos que contienen Neu5Gc y sus pares emparejados de controles (glicanos que contienen Neu5Ac), cada uno con una amina primaria de núcleo, están unidos covalentemente a diapositivas de vidrio revestidas con epoxi. Ejemplificamos la impresión de 56 diapositivas en un formato de 16 pozos utilizando una nano-impresora específica capaz de generar hasta 896 matrices por impresión. Cada diapositiva puede usarse para examinar 16 muestras de suero humano diferentes para la evaluación de la especificidad, intensidad y diversidad de anticuerpos anti-Neu5Gc. El protocolo describe la complejidad de esta herramienta robusta y proporciona una guía básica para aquellos que buscan investigar la respuesta al antígeno de carbohidratos dietéticos Neu5Gc en diversas muestras clínicas en un formato de matriz.
Introduction
Los sias son azúcares ácidos que cubren las cadenas de glicanos sobre las glicoproteínas de la superficie celular y los glicolípidos en los vertebrados. La expresión de Sia se modifica en las células cancerosas 1 y se correlaciona con la progresión y / o metástasis 2 , 3 . Dos de las principales formas de Sia en los mamíferos son Neu5Ac y su forma hidroxilada, Neu5Gc 2 . Los seres humanos no pueden sintetizar Neu5Gc debido a una inactivación específica del gen que codifica la enzima CMAH. Este Sia no humano incorpora metabólicamente en las células humanas como "yo", originado de alimentos ricos en Neu5Gc dietéticos ( por ejemplo, carne roja) 4 , 5 . Neu5Gc está presente en niveles bajos en las superficies celulares de epitelios humanos y endotelios, pero se acumula especialmente en los carcinomas. Neu5Gc es reconocido como extraño por el sistema inmune humanos humoral 2 , 6 .La complejidad antigénica de Neu5Gc-glicanos puede surgir a múltiples niveles, incluyendo Neu5Gc modificación, vinculación, glycans subyacente y andamios, y su densidad, todo reflejado por la complejidad de anti-Neu5Gc respuesta de anticuerpos en los seres humanos [ 6] . Algunos de estos anticuerpos sirven como biomarcadores de carcinoma y inmunoterapéuticos potenciales [ 7] . El advenimiento de la síntesis quimioenzimática de diferentes sialoglicanos 8 abrió el camino para el más análisis en profundidad de dichos anticuerpos, facilitado por el uso de la tecnología de microarrays glicano 9, 10. Por lo tanto, con la facilidad de preparación y manipulación de grandes bibliotecas de carbohidratos naturales y sintéticos, los microarrays de glicano se han convertido en una poderosa tecnología de alto rendimiento para investigar las interacciones de los carbohidratos con una miríada de biomoléculas 10 , 11 , </sup> 12 , 13 . En un formato de matriz, se utilizan cantidades mínimas de materiales, y esta presentación multivalente de glicanos biológicamente relevantes permite la investigación de miles de interacciones de unión en un solo experimento. Es importante destacar que esta tecnología también puede aplicarse al descubrimiento de biomarcadores y al seguimiento de respuestas inmunes en varias muestras [ 7 , 12] .
La fabricación exitosa de microarray de glycan requiere la consideración de tres aspectos importantes: el tipo de robot de impresora, la química de conjugación de glicano y la óptica de detección. En cuanto a la consideración del instrumento de impresión, existen dos técnicas: impresoras de contacto y sin contacto. En la impresión de contacto, se sumergen 1-48 clavijas de acero en una placa de fuente de pocillos múltiples que contiene solución de glicano y se manchan en portaobjetos de vidrio funcionalizados poniendo en contacto directamente la superficie de deslizamiento de vidrio. La cantidad de solución deQue se fija a la corredera es una función de la duración prolongada de la superficie de deslizamiento. Por lo general, las muestras se pre-manchan primero en un bloque de vidrio (para llegar a puntos homogéneos) antes de que se impriman en la superficie de la diapositiva. En impresoras sin contacto ( por ejemplo, la impresora piezoeléctrica), los glicanos se imprimen a partir de un capilar de vidrio usando señales eléctricas controladas. La señal eléctrica puede calibrarse finamente para conseguir una impresión más precisa en relación con la impresión por contacto. El tamaño y la morfología de las manchas son también relativamente más homogéneas. Una ventaja adicional es el reciclado de la muestra de vuelta a la placa fuente después de la impresión. Sin embargo, la principal desventaja de las impresoras piezoeléctricas es la limitación de la punta de impresión (4 u 8), dando como resultado una duración de impresión muy larga, lo que requiere una especial atención a la estabilidad de la diapositiva, temperatura, humedad y evaporación de la muestra. La impresora de inyección de tinta sin contacto requiere volúmenes de muestra más grandes 14 .
<p class = "jove_content"> En contraste con las limitadas opciones disponibles para los métodos de impresión, la química de conjugación de glicanos es una consideración más compleja, con muchas opciones para elegir. La química de inmovilización seleccionada debe tener en cuenta tanto los grupos activos sobre los glicanos como la reactividad de la superficie deslizante. Los glicanos que se inmovilizarán sobre una superficie de microarrays específica, sintetizada sintéticamente o aislada naturalmente, requieren un grupo reactivo idéntico. Además, los glicanos necesitan ser puros y homogéneos. Por otro lado, la superficie de inmovilización y la química deben proporcionar reproducibilidad y densidad de unión fiable. Se han desarrollado múltiples métodos de inmovilización con uniones covalentes o no covalentes (absorción física) 10 , 11 , 12 , 13 . Para información altamente detallada sobre la tecnología de microarray de glicano impreso para los no iniciadosD investigador, refiérase a estas excelentes revisiones 13 , 15 . Es importante destacar que la reciente información mínima requerida para una iniciativa de Glycomics Experiment (MIRAGE) describe pautas para la preparación de muestras 16 y para reportar los datos de los análisis de microarray de glycan 17 para mejorar los estándares en este campo en crecimiento.Aquí, describimos un protocolo detallado para la fabricación de sialoglycan microarrays utilizando un contacto específico nano-impresora en un formato de 16 pozos. Cada uno de los glicanos tiene una amina primaria que median su enlace covalente con diapositivas de vidrio activadas con epoxi. También describimos el desarrollo y el análisis de una diapositiva usando varias muestras de suero humano, anticuerpos y lectinas de plantas de unión a Sia. Los ensayos de microarrays de Sialoglycan implican varios pasos importantes que incluyen la fabricación, procesamiento, desarrollo y análisis de la matriz. La fabricación de arrays requiere la planificación del arLa preparación de los glicanos y la placa fuente, la programación de la nano-impresora y la impresión de las diapositivas. Posteriormente, las diapositivas se procesan, desarrollan y analizan ( Figura 1 ).
Protocol
Representative Results
Discussion
Una fabricación exitosa de microarray de glycan requiere una planificación cuidadosa e incluye varios pasos importantes en el protocolo. Estos incluyen: (1) la planificación de los diseños de bloques y placas que definen todos los parámetros subsiguientes ( por ejemplo, distancias, espaciado, cantidad de muestras e impresión); (2) limpiar los pasadores y asegurar la integridad del pasador, lo cual es crítico para controlar la homogeneidad del punto; (3) mantener una alta humedad durante la impresión, fu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por un Premio de Investigación de Desarrollo de Carrera del Fondo de Investigación de Cáncer de Israel, una subvención de la Iniciativa Nacional de Nanotecnología de Israel y el Helmsley Charitable Trust para un Área de Tecnología Focal en Nanomedicines para Theranostics Personalizada (VP-K) Institutos de Salud R01GM076360 (a XC).
Materials
| Primary-amine containing sialoglycans | Glycohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services) | Contact info@glycohubusa.com for compound requests | Printed glycans |
| Monosodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | Printing buffer component |
| Disodium phosphate heptahydrate | Sigma | S9390 | Printing buffer component |
| Phosphate buffered saline | Hy-Labs | BP-507/500D | Printing buffer/ incubation/washing buffer |
| Tris-base | Sigma | T1503 | Slide blocking reagent |
| Glycerol | Sigma | G-7893 | Printing buffer component |
| Ethanolamine | Thermo-Fisher Scientific | 0700/08 | Slide blocking reagent |
| Ovalbumin (Grade V) | Sigma | A5503 | Slide Blocking protein |
| Tween-20 | Sigma | P7949 | Slide washing detergent |
| Alexa 555-Hydrazide | Thermo-Fisher Scientific | A20501MP | Marker on array |
| ChromPure Human IgG, whole molecule | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 | Printing component |
| Biotinylated- SNA | Vector Laboratories | B-1305 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–6-linked |
| Biotinylated-MALII | Vector Laboratories | B-1265 | Plant Lectin – binding Sia-alpha2–3-linked |
| Chicken-anti Neu5Gc IgY | BioLegend | 146903 | Primary detection |
| Cy3-Streptavidin | Jackson Immunoresearch | 016-160-0848 | Biotin binding |
| Cy3-anti Human IgG | Jackson Immunoresearch | 109-165-088 | Secondary detection against human IgG |
| Cy3-anti Chicken IgY | Jackson Immunoresearch | 703-165-155 | Secondary detection against chicken IgY |
| Human sera samples | Israeli Blood Bank | Primary detection | |
| Compressed Nitrogen (Grade 5) | General dusting/drying tool | ||
| Epoxy-coated slides | Corning | 40044 | Slides |
| Epoxy-coated slides | PolyAn | 2D 104-00-221 | Slides. In this type of slides the surface is more hydrophobic (compared to Coring slides) therefore the glycans Print Buffer would need to be supplemented with 0.005% Tween-20 to obtain 100 µm size spots. |
| 384-well microtiter plate | Genetix | 2070 | Printing plate |
| VWR lab marker | VWR | 52877-310 | Slide labeling |
| Staining Tube | ArrayIt | MST | Slide developing tool |
| Staining bath | VWR | 25608-904 | Slide developing tool |
| Slides glass holders | VWR | 631-9321 | Slide developing tool |
| GenePix Scanner | Molecular devices | 4000B | Slide scanner |
| LM-60 NanoPrinter | ArrayIt | LM-60 | Array printer |
| Pins | ArrayIt | 946MP3 | Printing pins |
| ProPlate Module | Grace Bio-Labs | P37004 | Slide developing module |
| Distilled water | Bio-Lab | 2321020500 | Required for arrayer and humidifier |
| Electronic Multi Pippete, 8 Channel , volume range 2-125 μL | Thermo-Fisher Scientific (Matrix) | MA-2131 Impact2 Equalizer 384 | Multi pippete for sample dispansing into 384-well plate |
References
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