وصف الهجرة الخلية في إطار ثلاثي الأبعاد في المختبر الجرح البيئات
Summary
والهدف من هذا البروتوكول تقييم أثر العوامل برو ومكافحة ميجراتوري على الهجرة الخلية داخل مصفوفة فيبرينوجين ثلاثي الأبعاد.
Abstract
حاليا، معظم نماذج في المختبر لالتئام الجروح، مثل فحوصات الصفر الراسخة، تشمل دراسة إغلاق الخلية الهجرة والجرح على السطوح ثنائية الأبعاد. ومع ذلك، البيئة الفسيولوجية في الجرح الذي في فيفو الشفاء يأخذ مكان ثلاثي الأبعاد بدلاً من الأبعاد. أصبح من الواضح بشكل متزايد أن سلوك الخلية يختلف إلى حد كبير في الأبعاد مقابل بيئات ثلاثية الأبعاد؛ ولذلك، هناك حاجة للنماذج ذات الصلة أكثر فسيولوجيا في المختبر لدراسة سلوك الهجرة الخلية في إغلاق الجرح. الأسلوب الموصوفة هنا يسمح لدراسة الهجرة الخلية في نموذج ثلاثي الأبعاد التي تعكس بصورة أفضل الظروف الفسيولوجية من فحوصات الصفر ثنائي الأبعاد المحددة سابقا. والغرض من هذا النموذج تقييم ثمرة الخلية عن طريق فحص الهجرة الخلية بعيداً عن جسم كروي مضمنة داخل مصفوفة فيبرينوجين حضور عوامل برو أو مكافحة ميجراتوري. باستخدام هذا الأسلوب، ثمرة خلية من جسم كروي في مصفوفة ثلاثية الأبعاد يمكن ملاحظتها وهي قابلة للقياس بسهولة مع مرور الوقت عن طريق الفحص المجهري برايتفيلد وتحليل لمنطقة جسم كروي. يمكن أيضا تقييم تأثير العوامل الكثيرة الارتحال برو و/أو المثبطة على الهجرة الخلية في هذا النظام. يوفر هذا الأسلوب الباحثين مع طريقة بسيطة لتحليل الهجرة الخلية في الجرح ثلاثي الأبعاد المرتبطة المصفوفات في المختبر، مما يزيد من أهمية المختبر في الخلية دراسات مسبقة لاستخدام الحيوانات في فيفو نماذج.
Introduction
التئام الجروح هو عملية معقدة مما يؤدي إلى استعادة سلامة الأنسجة بعد الإصابة. يتم تقسيم هذه العملية إلى أربع مراحل متداخلة يشملها الأرقاء والتهاب والانتشار ويعيد البناء، التي يتم تنظيمها بكل بمزيج معقد من الرموز القابلة للذوبان والخلية-مصفوفة التفاعلات والاتصالات خلية. 1 , 2 تزامن هذه الرموز يتحكم العديد من الاستجابات الخلوية في التئام الجروح بما في ذلك، الأهم من ذلك، الهجرة الخلية. 3 , 4 الهجرة الخلية عملية ديناميكية للغاية تعتمد على تعمل الخلوية والخصائص البيوكيميائية والفيزيائية للوسط المصفوفة خارج الخلية. 5 الخلايا باستمرار التحقيق بيئتهم المصفوفة خارج الخلية من خلال مسارات إنتغرين بوساطة؛ تسمح هذه العملية الخلايا بمعنى مجموعة واسعة من خصائص المصفوفة بما في ذلك التضاريس والصلابة، والحبس. ثنائي الأبعاد (2D) تحليل الهجرة خلية يوضح أن الهجرة هو القوة الدافعة وراء تشكيل لاميليبوديا في طليعة من خلال توليد حزم خيوط الأكتين. اللاحقة تشكيل الالتصاقات المحورية في طليعة، في تركيبة مع أكتوميوسين مدفوعة انكماش وتراجع في الحافة، محركات أقراص الخلية إلى الأمام. 6 الهجرة الخلوية “ثلاثي الأبعاد” (3D) حاليا ليست مفهومة جيدا، إلا أن الدراسات الأخيرة تبين بأن الهجرة 3D اختلافاً مما ضوئها وصف الآلية في 2D، والمرجح أن تحركها آليات بديلة. على سبيل المثال، الدراسات الحديثة من بيتري وآخرون. أظهرت أن الخلايا في مصفوفات ثلاثية الأبعاد يمكنك التبديل اعتماداً على خصائص إدارة المحتوى في المؤسسة، بين لاميليبوديوم ولوبوبوديوم مدفوعة آليات الهجرة. 7 نظراً للهجرة الخلية عنصر حاسم للجرح شفاء استجابة، نماذج ثلاثية الأبعاد للهجرة الخلية ذات أهمية حاسمة لفهم الاستجابات الفسيولوجية للمنبهات المختلفة أثناء التئام الجروح. على الرغم من أن سلوك الخلية المهاجرة على الأسطح 2D ثبت أن تختلف اختلافاً كبيرا من الهجرة في مصفوفات ثلاثية الأبعاد، الأكثر حداثة في المختبر نماذج الهجرة الخلية خلال الجرح شفاء العملية، بما في ذلك الفحص الصفر الراسخة، الاستفادة من 2D أحادي الطبقة الثقافات. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 فحوصات أكثر وضعت مؤخرا استخدمت مصفوفة ثلاثية الأبعاد، ولكن لا تزال الثقافة الخلايا في أحادي الطبقة على رأس المصفوفة، مما يحد من القدرة على الخص حقاً ثريديمينسيوناليتي البيئة خلية المجراة في. 15
وغرض الأسلوب الموصوفة هنا دراسة الهجرة الخلية في نموذج ثلاثي الأبعاد ذات صلة الفيزيولوجية، وليس على سطح ثنائي الأبعاد، بغية التوصل إلى فهم أكثر قوة للردود الهجرة المرتبطة بالمنبهات التطبيقية. يسمح هذا الأسلوب للتقييم للهجرة الخلية داخل مصفوفة 3D فيبرينوجين جلطة حضور عوامل تنشيط أو تمنع المسارات المرتبطة بالهجرة الخلية. مصفوفة فيبرينوجين تم اختياره لهذا الأسلوب بسبب اللعب فيبرينوجين دوراً حاسما في المراحل المبكرة من التئام الجروح؛ الإصابات التالية، جلطة فيبرينوجين تتشكل داخل بيئات الجرح لوقف فقدان الدم ويعمل سقالة لتسلل خلية أولية أثناء إصلاح الأنسجة وإعادة عرض. 2 , 16 , 17 , 18 , 19 , بالإضافة إلى ذلك، 20 فيبرينوجين يستخدم سريرياً كتسرب جراحية وتكوين السدود قد تم مرتبطة بالهجرة الخلية، وفي نهاية المطاف نتائج الشفاء. دراسة سابقة أجرتها كوكس وآخرون. التحقيق الهجرة تنتجها الخلايا الليفية بجلطات فيبرينوجين تتألف من فيبرينوجين متفاوتة وتركيزات ثرومبين غرض الاستفادة المثلى من تسرب فيبرينوجين. في هذه الدراسات، وكان كمياً هجرة الخلايا من جلطات فيبرينوجين على الأطباق البلاستيكية. 20 هنا نقدم أسلوب يسمح للتحديد الكمي لهجرة خلايا داخل بيئة فيبرينوجين 3D. بينما يستخدم الأسلوب الموصوفة في هذا البروتوكول تحديداً فيبرينوجين، يمكن تعديل هذا النموذج بسهولة استخدام مواد بديلة المصفوفة كما هو مطلوب، مثل الكولاجين أو المصفوفات الأخرى 3D. بالإضافة إلى ذلك، نقدم استخدام تنتجها الخلايا الليفية الماغنيسيوم في هذا التحليل لأن الهجرة تنتجها الخلايا الليفية في السرير الجرح أمر بالغ الأهمية لتوليف المصفوفة خارج الخلية والأنسجة إصلاح/إعادة عرض. ومع ذلك، هي العَدلات العملية خلال الإصلاح نوع الخلية الأولى ترحيل إلى السرير الجرح، وتليها الضامة. ثم تبدأ الليفية للتسلل البيئة الجرح حوالي 48 ساعة بعد الإصابة الأولية، في بداية المرحلة التكاثري للجرح شفاء العملية. 19 هذا التحليل يمكن تعديلها بسهولة لتضمين العَدلات، الضامة، أو أنواع الخلايا الأخرى لتقييم كيف تؤثر التغييرات في هيكل فيبرينوجين جلطة الهجرة أنواع هذه الخلية. 21
لتنفيذ هذا التحليل، أولاً، تتشكل كروي تنتجها الخلايا الليفية استخدام تعديل التقنيات الموضحة سابقا لزراعة الخلايا الجذعية. 22 كروي تنتجها الخلايا الليفية بعد ذلك نقل إلى مصفوفة فيبرينوجين 3D، وثمرة يمكن ثم بسهولة رصدها وقياسها كمياً على مدى عدة أيام. يأخذ هذا البروتوكول في حساب 3D النظم الفسيولوجية عن طريق تضمين الماغنيسيوم خلية ثلاثية الأبعاد داخل مصفوفة فيبرينوجين، وبالتالي تجنب أوجه القصور في الأهمية الناجمة عن استخدام سطح نمو 2D مع أحادي الطبقة خلية للسلوك النموذجي المهاجرة، في حين لا يزال يسمح لتقييم سلوك الخلية في بيئة عالية التي تسيطر عليها في المختبر .
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح هذا البروتوكول لدراسة الهجرة الخلية في التئام المرتبطة ECMs من خلال في المختبر نموذج الثلاثي الأبعاد. خطوة حاسمة في التنفيذ السليم لهذا الإجراء هو التنمية السليمة الماغنيسيوم تنتجها الخلايا الليفية؛ تركيز خلية أثناء إعداد الأمثل لتعطي بتركيز أولية من الخلايا 2,500 والإفلات، مما ي?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقدم التمويل لهذا العمل من خلال جمعية القلب الأمريكية (16SDG29870005) وولاية كارولينا الشمالية الدولة الجامعة للبحث والابتكار التمويل الأولى.
Materials
| Materials | |||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine | VWR | VWRL0148-0500 | DMEM already containing L-glutamine can also be used |
| 100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic | VWR | 10861-594 | Dishes of any size can be used for hanging drop culture |
| Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested | Sigma-Aldrich | 12306C-500ML | |
| L-glutamine | Fisher Scientific | ICN1680149 | Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine |
| Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Human Dermal Fibroblasts, neonatal | Thermo Fisher | C0045C | Can be replaced with other cell type of interest |
| 21 G x 1 1/2' needle | BD | 305167 | 22 G x 1 1/2 needles will also work |
| 1 mL syringe | VWR | 89174-491 | Syringes of any volume can be used |
| Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells) | VWR | 82051-004 | |
| Human Fibrinogen – Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted | Enzyme Research Laboratories | FIB 3 | Can be replaced with matrix protein of interest |
| Human Alpha Thrombin | Enzyme Research Laboratories | HT 1002a | May not be necessary depending on matrix protein of interest |
| Equipment | |||
| BSL2 cell culture hood | |||
| Cell culture incubator | |||
| Inverted microscope with 10X objective | |||
| Centrifuge compatibile with 15 mL tubes |
References
- Chester, D., Brown, A. C. The role of biophysical properties of provisional matrix proteins in wound repair. Matrix Biol. , (2016).
- Martin, P., Leibovich, S. J. Inflammatory cells during wound repair: the good, the bad and the ugly. Trends in Cell Biology. 15 (11), 599-607 (2005).
- Lin, B., Yin, T., Wu, Y. I., Inoue, T., Levchenko, A. Interplay between chemotaxis and contact inhibition of locomotion determines exploratory cell migration. Nat Commun. 6, 6619 (2015).
- Ngalim, S. H., et al. Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy. J Vis Exp. (74), (2013).
- Charras, G., Sahai, E. Physical influences of the extracellular environment on cell migration. Nat Rev. Mol Cell Biol. 15 (12), 813-824 (2014).
- Petrie, R. J., Yamada, K. M. Fibroblasts Lead the Way: A Unified View of 3D Cell Motility. Trends Cell Biol. 25 (11), 666-674 (2015).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).
- Carlson, M. W., Dong, S., Garlick, J. A., Egles, C. Tissue-Engineered Models for the Study of Cutaneous Wound-Healing. Bioengineering Research of Chronic Wounds. , 263-280 (2009).
- Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. J Cell Bio. 184 (4), 481-490 (2009).
- Fraley, S. I., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat Rev. Mol Cell Biol. 10 (8), 538-549 (2009).
- Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zänker, K. S., Dittmar, T. Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix. J Vis Exp. (92), (2014).
- Jonkman, J. E. N., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).
- Lämmermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Chen, Z., Yang, J., Wu, B., Tawil, B. A Novel Three-Dimensional Wound Healing Model. J Dev Biol. 2 (4), 198-209 (2014).
- Ross, R., Benditt, E. P. Wound healing and collagen formation. The J Cell Biol. 12 (3), 533-551 (1962).
- Sproul, E. P., Argraves, W. S. A cytokine axis regulates elastin formation and degradation. Matrix Biol. 32 (2), 86-94 (2013).
- Almine, J. F., Wise, S. G., Weiss, A. S. Elastin signaling in wound repair. Birth Defects REs C Embryo Today. 96 (3), 248-257 (2012).
- Tracy, L. E., Minasian, R. A., Caterson, E. J. Extracellular Matrix and Dermal Fibroblast Function in the Healing Wound. Adv Wound Care. 5 (3), 119-136 (2016).
- Cox, S., Cole, M., Tawil, B. Behavior of Human Dermal Fibroblasts in Three-Dimensional Fibrin Clots: Dependence on Fibrinogen and Thrombin Concentration. Tissue Eng. 10 (5-6), 942-954 (2004).
- Brown, A. C., Barker, T. H. Fibrin-based biomaterials: Modulation of macroscopic properties through rational design at the molecular level. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1502-1514 (2014).
- Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H. Preparation of anti-inflammatory mesenchymal stem/precursor cells (MSCs) through sphere formation using hanging drop culture technique. Curr Protoc Stem Cell Biol. 28, (2014).
- Bainbridge, P. Wound healing and the role of fibroblasts. J Wound Care. 22 (8), 410-412 (2013).
