환경 상처 3 차원 생체 외에서 내 셀 마이그레이션 특성화

Summary

이 프로토콜의 목표 3 차원 섬유 소 매트릭스 내에서 셀 마이그레이션에 프로 및 안티 migratory 요인의 효과 평가 하는 것입니다.

Abstract

현재, 대부분 체 외에서 모델의 상처 치유, 잘 설립 스크래치 분석 실험 등, 공부 하는 2 차원 표면에 셀 마이그레이션 및 상처 폐쇄를 포함. 그러나,는 vivo에서 상처 치유 장소에에서 생리 적인 환경을 3 차원 보다는 2 차원 이다. 그것은 셀 동작에 크게 차이가 점점 더 분명 되 고 2 차원 3 차원 환경; 대 따라서, 더 순수 관련 생체 외에서 상처 폐쇄에 셀 마이그레이션 동작을 공부에 대 한 모델에 대 한 필요가 있다. 여기 설명 하는 방법을 더 나은 이전 설립된 2 차원 스크래치 분석 실험 보다 생리 상태를 반영 하는 3 차원 모델에서 셀 이동의 연구에 대 한 수 있습니다. 이 모델의 목적은 셀 프로 또는 안티 migratory 요인 존재 섬유 소 매트릭스 내에 포함 된 회전 타원 체 몸에서 셀 이동의 시험을 통해 결과 평가 하는 것입니다. 이 메서드를 사용 하 여 3 차원 매트릭스에서 회전 타원 체 몸에서 세포 파생물 관찰 될 수 있다 고 명시 야 현미경 검사 법 및 회전 타원 체 본문 영역의 분석을 통해 시간이 지남에 쉽게 정량은. 셀 마이그레이션에 프로 철새 및 억제 요인의 효과 또한이 시스템에 평가할 수 있습니다. 연구원 관련 3 차원 상처 행렬에서 체 외에서세포 마이그레이션 분석의 간단한 방법을 제공 합니다, 그리고 에 체 외 의 관련성 증가 셀 학문 vivo에서 동물의 사용 하기 전에 모델입니다.

Introduction

상처 치유 하는 것은 부상 다음 조직의 무결성의 복원에 결과 복잡 한 과정 이다. 이 과정은 깨진 hemostasis, 염증, 확산 및 개장 하 고, 포함 하는 4 개의 겹치는 단계로 각 통제 되는 수용 성 신호, 세포-매트릭스 상호 작용 및 세포 세포 커뮤니케이션의 복잡 한 조합에 의해. ^{1 , 2} 이러한 단서의 오케스트레이션 다양 한 상처 치유를 포함 하 여, 중요 한 것은, 셀 마이그레이션에 세포질 응답을 제어 합니다. ^{3 , 4} 셀 이동 셀룰러 고기 그리고 기질 환경 생화학 및 생물 속성에 매우 역동적인 과정 이다. ⁵ 셀 지속적으로 integrin 중재 경로;를 통해 그들의 기질 환경 조사 이 과정에는 다양 한 지형, 감 금, 강성, 등 행렬 속성을 셀 수 있습니다. 2 차원 (2D) 분석 세포 이동의 마이그레이션 lamellipodia 형성 걸 필 라 멘 트 번들의 세대를 통해 첨단에 의해 구동 됩니다 하는 방법을 보여 줍니다. 후행 가장자리에 수축과 수축 구동 actomyosin 함께에서 첨단에 초점 유착의 후속 대형 셀 앞으로 드라이브. ^{그러나 6} three-dimensional (3D) 셀룰러 이동은 현재 잘 이해 하지,, 최근 연구 결과 3D 마이그레이션이 보다 뚜렷이 보여는 afore 2d에서 메커니즘을 설명 하 고 가능성이 그렇지 메커니즘에 의해 구동 됩니다. 예를 들어, 피치 외최근 연구. 시연, ECM의 속성에 따라 셀 3D 행렬에 lamellipodium 및 lobopodium 마이그레이션 메커니즘을 구동 간에 전환할 수 있습니다. ⁷ 셀 마이그레이션 응답을 치유 하는 상처의 중요 한 구성 요소 이므로 세포 이동의 3D 모델이 상처 치유 하는 동안 다양 한 자극에 생리 적인 응답을 이해 합니다. 상처 치유 과정, 잘 설립 스크래치 분석 결과 포함 하 여 동안 셀 이동의 최신 체 외에 모델 2D 활용 3D 매트릭스에서 마이그레이션에서 크게 다를 2D 표면에 셀 철새 동작 표시 되었습니다, 비록 단층 문화입니다. ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14} 더 최근 개발 분석 3 차원 매트릭스를 활용 하지만 여전히 따라서 진정으로 셀 환경 세를 정리 하는 능력을 제한 하는 매트릭스, 위에 단층 셀 문화 vivo에서. ¹⁵

여기에 설명 된 방법의 목적은 셀 마이그레이션 2D 표면이 아니라 순수 관련 3D 모델에 적용 된 자극과 관련 된 마이그레이션 응답의 더 강력한 이해를 얻기 위해 공부 하. 이 메서드는 셀 이동 활성화 하거나 연관 셀 마이그레이션 경로 억제 하는 요인의 3 차원 섬유 소 응고 매트릭스 내에서 평가 대 한 수 있습니다. 섬유 소 매트릭스 상처 치유;의 초기 단계에서 중요 한 역할 섬유 소 놀이 때문이 방법에 대 한 선정 다음 상해, 섬유 소 혈전 혈액 손실이 줄기 상처 환경에서 형성 되 고 조직 복구 및 리 모델링 하는 동안 초기 세포 침투에 대 한 비 계 역할. ^{2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} 또한, 섬유 소 임상 수술 실 란 트로 사용 하 고는 밀봉의 구성 세포 마이그레이션 및 궁극적인 결과 치유에 연결 되었습니다. 콕스 외이전 연구. 다양 한 섬유 소 및 섬유 소 실 란 트를 최적화 하기 위해 트 롬 빈 농도의 구성 하는 섬유 소 혈전과 섬유 마이그레이션을 조사. 이러한 연구에서 플라스틱 접시에 섬유 소 혈전에서 셀의 정량 했다. ²⁰ 여기 선물이 셀 3D 섬유 소 환경 내에서 이동의 정량화를 허용 하는 방법. 특히이 프로토콜에서 설명 하는 방법을 섬유 소를 사용 하는 동안이 모델은 원하는 대로, 교원 질 또는 다른 3D 매트릭스 같은 대안 매트릭스 재료를 사용 하 여 쉽게 수정할 수 있습니다. 또한, 선물이 구와 spheroids 사용 하 여가 분석이 결과에서 상처 침대로 구와 마이그레이션 기질 합성 및 조직 복구/리 모델링을 파라마운트 중요성 때문에. 그러나, 복구 하는 동안 프로세스 neutrophils 상처 침대, 대 식 세포에 의해 다음에 마이그레이션할 첫 번째 셀 유형입니다. 섬유 아 세포는 다음 상처 치유 과정의 증식 단계 시작 되는 시점에서 초기 부상 후 약 48 시간 상처 환경에 침투 하기 시작 합니다. ¹⁹ 이 분석 결과 수 있을 쉽게 포함 하도록 수정 호 중구, 대 식 세포, 또는 다른 세포 유형 섬유 소 혈전 구조 변경 이러한 세포 유형의 마이그레이션에 미치는 영향을 평가 하기 위해. ²¹

이 분석 결과 구현 하려면 먼저, 섬유 회전 타원 체 형성 된다 줄기 세포 배양에 대 한 이전 설명의 수정을 사용 하 여. ²² 섬유 회전 타원 체 이후 3D 섬유 소 매트릭스로 전송 되 고 파생물 수 다음 쉽게 모니터링 하 고 몇 일 동안 계량. 이 프로토콜은 계정에 생리 적 시스템의 3 차원 섬유 소 매트릭스 내에서 3D 셀 spheroids를 포함 하 여 따라서 세포 단층 모델 철새 행동을 함께 사용 하 여 2D 성장 표면에 의해 초래 하는 관련성에 한계를 피하, 동안 아직도 매우 제어 체 외에서 환경에서 셀 동작의 평가 대 한 허용.

Protocol

1. 1 일: 셀 및 시 약 준비 참고: 모든 셀 및 시 약 준비 생물 안전 캐비닛 샘플의 오염을 방지 하기 위해 수행 되어야 합니다. 따뜻한 필터링 Dulbecco ' s 수정이 글 ' s 매체 (DMEM), 소 태아 혈 청 (FBS), L-글루타민, 고 37 ° C 물 욕조에 페니실린/스. 보완 하 여 준비 신생아 인간 피부 섬유 아 세포 (HDFn) 미디어와 10 S, 1% 페니실린/스, 1 %DMEM 따뜻하게 L-글루타민.</…

Representative Results

회전 타원 체 문화 구와 마이그레이션 체 외에 프로 및 안티 철새 에이전트의 효과 평가에 이용 될 수 있다3D 구와 spheroids 72 h (그림 1)의 기간에 걸려 드롭 문화를 통해 형성 될 수 있습니다. 문화 기간에 따라 spheroids 응고 매트릭스에 포함 하 고 명시 야 현미경 검사 법 (그림 2)를 사용 하 여 몇 군데. Spheroids (흰색…

Discussion

이 프로토콜에는 상처 치유에 세포 이동의 시험 체 외에 3D 모델을 통해 소프트웨어 관련에 대 한 수 있습니다. 프로시저의 적절 한 실행에 중요 한 단계는 섬유 spheroids;의 적절 한 개발 준비 하는 동안 셀 농도 2500 셀/드롭의 초기 농도 주고 최적화 되었다 72 h의 인큐베이션 기간 동안 안정적으로 양식 spheroids을 허용. 셀의 수가 부족 사용 하는 경우 spheroids 효과적으로 집계 하지 있습니다 하 …

Materials

Materials
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine	VWR	VWRL0148-0500	DMEM already containing L-glutamine can also be used
100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic	VWR	10861-594	Dishes of any size can be used for hanging drop culture
Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested	Sigma-Aldrich	12306C-500ML
L-glutamine	Fisher Scientific	ICN1680149	Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine
Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Human Dermal Fibroblasts, neonatal	Thermo Fisher	C0045C	Can be replaced with other cell type of interest
21 G x 1 1/2' needle	BD	305167	22 G x 1 1/2 needles will also work
1 mL syringe	VWR	89174-491	Syringes of any volume can be used
Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells)	VWR	82051-004
Human Fibrinogen – Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted	Enzyme Research Laboratories	FIB 3	Can be replaced with matrix protein of interest
Human Alpha Thrombin	Enzyme Research Laboratories	HT 1002a	May not be necessary depending on matrix protein of interest
Equipment
BSL2 cell culture hood
Cell culture incubator
Inverted microscope with 10X objective
Centrifuge compatibile with 15 mL tubes