JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Biologie du développement

C. elegans Excretory kanalen som modell for intracellulær Lumen Morphogenesis og I Vivo polarisert membran Biogenesis i en enkeltcelle: merking av GFP-fusjoner, RNAi interaksjon skjermen og bildebehandling

Published: October 03, 2017
doi:
10.3791/56101
, , , , ,
1Mucosal Immunology and Biology Research Center, Developmental Biology and Genetics Core, Massachusetts General Hospital for Children,Harvard Medical School, 2College of Life Sciences,Jilin University, 3Faculty of Health Sciences,University of Macau

Summary

C. elegans excretory kanalen er en unik encellede modell for synlig i vivo analyse av de novo polarisert membran biogenesis. Denne protokollen beskriver en kombinasjon av standard genetisk/RNAi og imaging tilnærminger, tilpasses identifikasjon og karakterisering av molekyler regi encellede tubulogenesis og apikale membran og lumen biogenesis.

Abstract

Fire C. elegans excretory kanalene er smale rør utvides gjennom lengden på dyret fra en enkelt celle, med nesten like langt utvidet intracellulær endotubes som bygger og stabilisere lumen membranen og submembraneous cytoskeleton apikale karakter. Excretory cellen utvider sin lengde ca 2000 ganger for å generere disse kanalene, noe som gjør denne modellen unikt i vivo -vurdering av de novo polarisert membran biogenesis, intracellulær lumen morphogenesis og encellede tubulogenesis. Protokollen presenteres her viser hvordan kombinere standard merking, gevinst og tap-av-funksjon genetisk eller RNA-interferens (RNAi)-, og mikroskopiske tilnærminger bruker denne modellen til å visuelt dissekere og funksjonelt analysere disse prosesser på molekylært nivå. Som et eksempel på en etikettmetoden skisserer protokollen generering av transgene dyr med fluorescerende fusion proteiner for live analyse av tubulogenesis. Som et eksempel på en genetisk tilnærming fremhever det nøkkelpunkt av en visuell RNAi-basert samhandling skjerm designet for å endre en gevinst-av-funksjon cystisk kanalen fenotypen. De bestemte metodene beskrives slik: label og visualisere kanalene ved å uttrykke fluorescerende proteiner; lage et målrettet RNAi bibliotek og strategi RNAi screening for molekylær analyse av kanalen morphogenesis; vurdere visuelt modifikasjoner av kanalen fenotyper; score dem ved å dissekere fluorescens mikroskopi; kjennetegner subcellular kanalen komponenter med høyere oppløsning av AC confocal mikroskopi; og kvantifisere visuelle parametere. Tilnærmingen er nyttig for etterforsker som er interessert i å dra nytte av C. elegans excretory kanalen for å identifisere og karakterisere gener involvert i phylogenetically bevart prosessene av intracellulær lumen og encellede rør morphogenesis.

Introduction

Alle indre organer består av rør, avgjørende for sine mange ulike funksjoner, som transport og utveksling av gasser, væsker og næringsstoffer og utskillelse av metabolsk avfall. Deres polarisert karakter, med forskjellige apikale og lumenal membraner, er tilpasset disse bestemte funksjoner mangler i biogenesis av systemene endo- og plasma membranen er en hyppig årsak til menneskelig sykdom1,2. Fleste av rør er blodkar og indre organer er flercellede og danne en lumen intercellularly; Imidlertid kan encellede rør, som danner lumen intracellulært, for eksempel representere så mye som 30-50% av menneskelig kapillære senger2. Polarisert membraner av multi- og encellede rør er like i sammensetning, men deres microdomains kan variere basert på tuben bestemt funksjon (f.eks, excretory kanalen canaliculi mot intestinal microvilli i Caenorhabditis elegans; se medfølgende papir på C. elegans intestinal tubulogenesis)3. Prinsippene om polarisert membran biogenesis og tubulogenesis er bevart blant Metazoer, og en lignende molekylær maskiner leder dem1,2,4.

C. elegans excretory systemet består av fem celler: excretory cellen (EC), duct-cellen (DC), pore cellen (PC) og to kjertel celler. Ablasjon EC, DC eller PC fører væske opphopning i kroppens hulrom og dyr dør på en tidlig larvestadiet5. Intriguingly, disse tre encellede rør lage deres lumen på tre forskjellige måter: celle hollowing (EC); cellen innpakning kombinert med autocellular junction dannelse (PC); og av cellen innpakning kombinert med autofusion (DC); ulike mekanismer av lumen morphogenesis som alle phylogenetically bevart6,7. EF, ligger den laterale venstre bakre pharyngeal pære, sender ut to laterale utvidelser som fire kanalene armen ut til å utvide peke og posteriorly (på både høyre og venstre side) til tuppen av ormen nese og hale , henholdsvis (figur 1)5,6,8. EF går fra ca 1 µm til 2 x 1000 µm, og den største cellen i dyret. På et subcellular nivå er excretory kanalen en enkel tube, generert fra en basal membran rettet mot pseudocoelom og tunneled av en lumenal membran (endotube). Kanalen lumenal membranen kobles til rør lumenal membranen sin bare intercellulære avkjørsel; kanalene er ellers junctionless langs deres lengder (figur 1). Excretory kanalen lumenal membranen og dens submembraneous cytoskjelett er apikale, definert av molekylære sammensetningen som ligner sammensetningen av apikale membranen og submembraneous cytoskjelett flercellet rør, for eksempel tarmen, og andre (f.eksflat) epithelia. Cytoplasmatiske organeller, inkludert endosomal vesicula og andre (f.eksGolgi) endomembranes er fordelt langs kanalen. I tillegg er flere canalicular blemmer – enten koblet til lumenal membranen, og/eller sammenkoblet, eller isolert – tredd gjennom kanalen cytoplasma7,8,–9,10 . Denne dynamiske plasma-membran/canalicular tilkoblingen videre utvider kanalsystemet membran og bidrar til både lumen morphogenesis og osmoregulation10. Excretory kanalen dermed består nesten utelukkende av endo- og plasma membraner, gir en utmerket modell for analyse av polarisert membran biogenesis og regulering av endo-plasma membranen grensesnitt. Dramatisk utvidelse av apikale membranen under kanalen morphogenesis – i én celle systemet samtidig med lumen utvidelsen-kan også analysere de arkitektoniske problemene som følge av behovet for å stabilisere og sentrum en intracellulær lumenal membran . Denne protokollen fokuserer på analyse av kanalen tunnelbane og lumen’s strukturelle morphogenesis og intracellulær membran dynamikken kreves for denne prosessen ikke på signaler som direkte celle bevegelser som genererer EUs posisjon i den excretory systemet og bygge sine intrikate forbindelser til andre Mobiltlf elementer (omtalt i6).

Enda en fordel av C. elegans encellede kanalen system for analyse av polarisert membran og intracellulær lumen biogenesis er dens evne til å skille, gjennom utviklingsmessige tid, generering av ulike komponenter i sin membraner og veikryss. EU er født ved ventrale nedleggelse og utligner ventro-lateralt av pharynx under midten embryogenesis5,6,8, når tid lateral kanalen forlengelse og forgrening forekomme. Dette etterfølges av anterior-posterior kanalen under sent embryogenesis, en prosess som fortsetter L1-larvestadiet (figur 1). I en nyklekte larven, bakre kanalen spissen når ca midten av ormen, fullt utvide til halen på slutten av L1 scenen, etter hvilken tid kanalen elongates sammen med ormen8. Aktiv kanal vekst med en hastighet over av dyrets vekst dermed ender på første larvestadiet, men ytterligere vekst skjer parallelt med veksten av hele dyret under den ekstra larver stadier (L2-4). Denne innstillingen gir mulighet til å analysere forskjellige trinn av de novo polarisert membran biogenesis uavhengig av polarisert celledeling eller migrering. Dessuten, det tillater separasjon av denne prosessen fra monteringen av veikryss (som forekommer i embryo før lumen Start); deres nøyaktige krav i membranen polarisering er fortsatt et åpent spørsmål i feltet polaritet. Til slutt, det unikt skiller apikale fra basale membran ekspansjon, sistnevnte prosessen før tidligere i excretory kanalene10. C. elegans excretory kanalen modellen er derfor spesielt informativ supplerer intestinal modellen som deler en rekke fordelene for analyse av polarisert membran biogenesis men utfører den i en flercellet (se det medfølgende papiret på intestinal tubulogenesis3).

Selv om vill-type kanalene ultrathin tubules i denne lille ormen, kan deres lumen visualized direkte av Nomarski optikk i denne gjennomsiktige dyr. Faktisk kan mutant cystisk kanalen morphologies være preget i umerkede dyr med lav forstørrelse dissekere mikroskopi, som har blitt brukt med stor virkning i fremover genetisk skjermene for å identifisere tilblivelse involvert inne tubulogenesis11. Forbedret visualisering av morfologi av kanalene og forskjellsbehandling av deres polarisert membraner, cellen cytoskjelett komponenter, ulike intracellulær organeller og andre subcellular strukturer, men krever merking og høyere makt lysstoffrør dissecting og AC confocal mikroskopi. Selv om kanalene fine struktur innebærer en rekke vanskeligheter for merking og mikroskopi, membraner og subcellular komponenter kan skilles via bestemte molekylene unike for hver avdeling, og dyr kan være trygt montert for mikroskopi hvis visse forholdsregler er tatt for å unngå å innføre gjenstander (se protokollen og diskusjon). Merking kan gjøres av immunhistokjemi i fast prøver, eller ved å generere transgene ormer uttrykke fluorescerende fusion proteiner under kontroll av sine egne eller excretory kanalen-spesifikke arrangører for i vivo bildebehandling. Denne protokollen beskriver den sistnevnte merking teknikken (se medfølgende avisen intestinal tubulogenesis for antistoff flekker3).

Muligheten til å kombinere i vivo tap eller vinning-av-funksjon studier med i vivo imaging analyse på enkelt cellen nivå gjennom utvikling gjør C. elegans excretory kanalen en spesielt sterk modell for den molekylære og mobilnettet analyse av encellede tubulogenesis. Fremover eller bakover genetisk skjermer kan utføres med en vill-type eller merket transgene dyr å identifisere kanalen morphogenesis fenotyper (for eksempel cyster) og deres underliggende genet defekter. Slike skjermer kan eventuelt starte med en mutant fenotypen (f.eks, en cystisk kanal) og identifisere suppressors eller enhancers av denne fenotypen identifisere gener som funksjonelt samhandler med genen forårsaker mutant fenotypen. Den genetisk defekten forårsaker mutant fenotypen kan indusere tap (f.eks, via genet sletting) eller en gevinst (f.eks via en aktivering mutasjon eller via innføringen av overflødig genet kopier) av funksjonen undersøkt. Videresender mutagenese eller systematisk RNAi skjermer uten fordommer på gen funksjon og tillate objektiv identifikasjon av tilblivelse involvert inne funksjonen av interesse. Gitt at genomet hele RNAi fôring biblioteker, kan nesten hver genet være lett slått ned av RNAi i C. elegans, slik at en enkelt genet av interesse eller grupper av gener (f.eksi målrettede skjermer) kan også være raskt analysert for deres effekt i en omvendt genetikk tilnærming. For å demonstrere en mulig kombinasjon av tilnærminger, her beskriver vi en målrettet RNAi interaksjon skjerm, starter med en gevinst-av-funksjon cystisk excretory kanalen mutant, merket med cytoplasmatiske kanalen grønne fluorescerende protein (GFP). Mutant fenotypen ble generert av overuttrykte erm-1, en høyt konservert C. elegans ortholog av membran-utgangen koblingsfunksjonalitet familien Ezrin-Radixin-Moesin (ERM), som har vært innblandet i lumen morphogenesis og membran organisasjonen i mange arter12. C. elegans ERM-1 regionaliserer å lumenal membraner av indre organer, som excretory kanalen og tarmen, og kreves for lumen formasjon i begge13. ERM-1 overuttrykte rekrutter overflødig utgangen og blemmer til kanalen lumenal membran, øke forandring i lumen og generere en kort cystisk kanal og en crimped lumenal membran med fortykket begrepsordbok underlaget9. Protokollen beskriver hvordan å generere transgene stammer med excretory-kanalen-uttrykt merket fusion proteiner (eller andre proteiner); utføre målrettet RNAi skjermer med slike stammer, identifisere modifikatorer av en kanalen fenotypen; og visuelt analysere resultatene av slike skjermer av fluorescens dissecting og AC confocal mikroskopi, inkludert enkle måter å kvantifisere informativ tubulogenesis fenotyper. Alternativ merking teknikker og detaljer om RNAi, justert til ofte dødelig tubulogenesis genene, kan finnes i tilhørende papir på intestinal tubulogenesis3. Alle metoder kan brukes i ulike kombinasjoner for etterforskningen av andre spørsmål på kanalen tubulogenesis.

Protocol

1. merking C. elegans Excretory kanalen av fluorescerende Fusion proteiner 14 Merk: se medfølgende avisen intestinal tubulogenesis 3 for merking av i situ antistoff flekker prosedyrer tilpasses excretory kanalen. Se tabell 1 for eksempler på molekyler vist seg nyttig for å visualisere C. elegans excretory kanalen endo- og plasma membraner, tabell 2 eksempler på arrangører kjøri…

Representative Results

Denne protokollen beskriver hvordan du bruker C. elegans excretory kanalene å visuelt og molecularly analysere encellede tubulogenesis og intracellulær lumen morphogenesis i en enkelt celle. Under filtyper fra tidspunktet for midt embryogenesis til voksen fortsetter fire excretory kanalene å utvide sin basolateral og apikale/lumenal membraner sammen med deres canalicular og endosomal endomembrane system, som gir en unik modell for i vivo analyse av de novo po…

Discussion

C. elegans genetisk allsidighet, åpenhet, enkel kroppen planen og konstant celle avstamning alle gjør det til en utmerket modell for analyse av morphogenesis. Denne protokollen beskriver hvordan kombinere standard genetisk manipulasjon og tenkelig studier for å dra nytte av de 2 mikron tynn C. elegans excretory kanaler for å studere polarisert membran og intracellulær lumen biogenesis i en enkelt celle rør.

Merking
C. elegans excretory kanal…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker M. Buechner (University of Kansas, Kansas, USA), K. Nehrke (University of Rochester Medical Center, Rochester, New York, USA) og Caenorhabditis genetikk sentrum, finansiert av National Institutes of Health, Office for forskningsinfrastruktur Programmer (P40 OD010440). Dette arbeidet ble støttet av tilskudd NIH GM078653 og MGH er 224570 SAA 223809 til V.G.

Materials

Cloning
Plasmid pPD95.75 Addgene Cat. No. 37464
PCR Kit Qiagen Cat. No. 27106
Ligation kit New England Biolabs Cat. No. E2611L
DNA marker Thermo Scientific Cat. No. SM1331
Agarose DNA grade Fisher Scientific Cat. No. BP164-100
Competent cells New England Biolabs Cat. No. C2987H
Tris Fisher Scientific Cat. No. BP154-1
EDTA Sigma Cat. No. ED-1KG
Acetic acid Fisher Scientific Cat. No. A38S-500
Ethidium bromide Fisher Scientific Cat. No. BP1302-10
Equipments
PCR machine  MJ Research Cat. No. PTG-200 
Centrifuge Eppendorf  Cat. No. 5415C
Water Bath Precision Scientific  Cat. No. 666A3 
Gel running instrument Fisher Scientific Cat. No. 09-528-165
Gel running power supply Fisher Scientific Cat. No. 45-000-465
Molecular Imager Gel Doc XR System Bio-Rad Cat. No. 1708195EDU
Nanodrop Spectrophotometer Thermo Scientific Cat. No. ND1000
C. elegans related1 1see reference27 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates2 2see reference24 for protocols.
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Yeast Extract BD Biosciences Cat. no. 212750
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
Ampicillin Sigma Cat. no. A0116
Tetracycline Fisher Scientific Cat. no. BP912
M9 Medium2 2see reference24 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
Na2HPO4 Sigma Cat. no. S7907
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
NGM plates 2 2see reference24 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Peptone  BD Biosciences Cat. no. 211677
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
CaCl2 Sigma Cat. no. C3881
Cholesterol  Sigma Cat. no. C8667
K2HPO4  Sigma Cat. no. P3786
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
RNAi plates3 3see reference60 for protocols.
NaCl Sigma Cat. no. S7653
Peptone  BD Biosciences Cat. no. 211677
Tryptone  Acros Organics Cat. no. 611845000
Bacto Agar  BD Biosciences Cat. no. 214040
MgSO4 Sigma Cat. no. M2773
CaCl2 Sigma Cat. no. C3881
Cholesterol  Sigma Cat. no. C8667
K2HPO4  Sigma Cat. no. P3786
KH2PO4 Sigma Cat. no. P0662
IPTG  US Biological Cat. no. I8500
Carbenicillin Fisher Scientific Cat. no. BP2648
NaOH Fisher Scientific Cat. no. SS266-1
Sodium hypochlorite Fisher Scientific Cat. no. 50371500
Bacteria
OP50 bacteria CGC
HT115 bacteria CGC
Genome-wide RNAi libraries
Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref29,49) Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref50) Source BioScience
Imaging related
Lidocaine MP Biomedicals,LLG Cat. no. 193917
Materials
Vacuum Grease Silicone Beckman Cat. no. 335148
Microscope slides  Fisher Scientific Cat. no. 4448
Microscope coverslips (22×22-1） Fisher Scientific Cat. no. 12-542-B
Tissue culture plate, 6 well  Corning Inc. Cat. no. 08-772-33
Equipment
SMZ-U dissecting microscope (Nikon)
SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions).
TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem)
C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon)
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lubarsky, B., Krasnow, M. A. Tube morphogenesis: making and shaping biological tubes. Cell. 112 (1), (2003).
  2. Sundaram, M. V., Cohen, J. D. Time to make the doughnuts: Building and shaping seamless tubes. Semin. Cell Dev. Biol. S1084-9521, 30130-30136 (2016).
  3. Zhang, N. The C. elegans intestine as a model for intercellular lumen morphogenesis and in vivo polarized membrane biogenesis at the single-cell level. JoVE. , (2017).
  4. Andrew, D. J., Ewald, A. J. Morphogenesis of epithelial tubes: Insights into tube formation, elongation, and elongation. Dev. Biol. 341 (1), 34-55 (2010).
  5. Nelson, F. K., Albert, P. S., Riddle, D. L. Fine structure of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system. J. Ultrastruct. Res. 82 (2), 156-171 (1983).
  6. Sundaram, M. V., Buechner, M. The Caenorhabditis elegans Excretory System: A Model for Tubulogenesis, Cell Fate Specification, and Plasticity. Génétique. 203 (1), 35 (2016).
  7. Altun, Z. F., Hall, D. H. Excretory system. WormAtlas. , (2009).
  8. Buechner, M. Tubes and the single C. elegans excretory cell. Trends Cell Biol. 12 (10), 479-484 (2002).
  9. Khan, L. A. Intracellular lumen extension requires ERM-1-dependent apical membrane expansion and AQP-8-mediated flux. Nat. Cell Biol. 15 (2), 143-156 (2013).
  10. Kolotuev, I., Hyenne, V., Schwab, Y., Rodriguez, D., Labouesse, M. A pathway for unicellular tube extension depending on the lymphatic vessel determinant Prox1 and on osmoregulation. Nat. Cell Biol. 15 (2), 157-168 (2013).
  11. Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Dev. Biol. 214 (1), 227-241 (1999).
  12. Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11 (4), 276-287 (2010).
  13. Gobel, V., Barrett, P. L., Hall, D. H., Fleming, J. T. Lumen morphogenesis in C. elegans requires the membrane-cytoskeleton linker erm-1. Dev. Cell. 6 (6), 865-873 (2004).
  14. Sambrook, J., Sambrook, J., DW, R. u. s. s. e. l. l. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2006).
  15. Fire, A., Harrison, S. W., Dixon, D. A modular set of lacZ fusion vectors for studying gene expression in Caenorhabditis elegans. Gene. 93 (2), 189-198 (1990).
  16. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  17. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  18. Pawley, J. B. . Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).
  19. Hibbs, A. R. . Confocal Microscopy for Biologists. , (2004).
  20. Bankhead, P. . Analyzing fluorescence microscopy images with ImageJ. , (2014).
  21. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Génétique. 157 (3), 1217-1226 (2001).
  22. Frøkjaer-Jensen, C. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).
  23. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).
  24. Barrangou, R. Cas9 Targeting and the CRISPR Revolution. Science. 344 (6185), 707-708 (2014).
  25. Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Génétique. 202 (3), 885-901 (2016).
  26. Esposito, D., Garvey, L. A., Chakiath, C. S. Gateway cloning for protein expression. Methods Mol. Biol. 498, 31-54 (2009).
  27. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat. Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  28. Hobert, O. PCR fusion-based approach to create reporter gene constructs for expression analysis in transgenic C. elegans. Biotechniques. 32 (4), 728-730 (2002).
  29. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat. Rev. Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
  30. Berry, K. L., Bulow, H. E., Hall, D. H., Hobert, O. A. C. elegans CLIC-like protein required for intracellular tube formation and maintenance. Science. 302 (5653), 2134-2137 (2003).
  31. Mattingly, B. C., Buechner, M. The FGD homologue EXC-5 regulates apical trafficking in C. elegans tubules. Dev. Biol. 359 (1), 59-72 (2011).
  32. Shaye, D. D., Greenwald, I. The disease-associated formin INF2/EXC-6 organizes lumen and cell outgrowth during tubulogenesis by regulating F-actin and microtubule cytoskeletons. Dev. Cell. 32 (6), 743-755 (2015).
  33. Lant, B. CCM-3/STRIPAK promotes seamless tube extension through endocytic recycling. Nat. Commun. 6 (6), 6449 (2015).
  34. Paupard, M. C., Miller, A., Grant, B., Hirsh, D., Hall, D. H. Immuno-EM localization of GFP-tagged yolk proteins in C. elegans using microwave fixation. J. Histochem. Cytochem. 49 (8), 949-956 (2001).
  35. Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).
  36. Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
  37. Sherman, T. The abts and sulp families of anion transporters from Caenorhabditis elegans. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 289 (2), C341-C351 (2005).
  38. . Transgeneome website Available from: https://transgeneome.mpi-cbg.de/transgeneomics/index.html (2017)
  39. . National BioResource Project (NBRP)::C. elegans Available from: https://shigen.nig.ac.jp/c.elegans/ (2017)
  40. Heppert, J. K. Comparative assessment of fluorescent proteins for in vivo imaging in an animal model system. Mol. Biol. Cell. 27 (22), 3385-3394 (2016).
  41. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  42. . BLAST Available from: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2017)
  43. Kamath, R. S., Martinezcampos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002 (2001).
  44. Kamath, R. S. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
  45. Rual, J. F. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome research. 14 (10B), 2162-2168 (2004).

Tags

C. ElegansExcretory CanalIntracellular LumenPolarized Membrane BiogenesisTubulogenesisPolarityGFP FusionRNAiLive ImagingMembrane MarkersOrganelle MarkersPromotersERM-1Cystic Canal PhenotypeModifier Screen

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Zhang, N., Membreno, E., Raj, S., Zhang, H., Khan, L. A., Gobel, V. The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging. J. Vis. Exp. (128), e56101, doi:10.3791/56101 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image