В C. elegans Excretory канал как модель для внутриклеточного люмен морфогенеза и In Vivo поляризованной мембраны биогенеза в одной ячейке: маркировка GFP-расплавы, RNAi взаимодействие экрана и изображений

Summary

В C. elegans выделительной канал является уникальный одноячеечной модели для анализа визуальных в vivo биогенеза de novo поляризованной мембраны. Этот протокол описывает сочетание стандартных генетических/RNAi и изображений подходы, пригодных для идентификации и определения характеристик молекул, направляя одноклеточные tubulogenesis и апикальном мембрана и Люмене биогенеза.

Abstract

Четыре C. elegans выделительной каналы являются узкие трубки продлен через длину животного из одной клетки, с почти одинаково далеко расширенной внутриклеточных endotubes, что строить и стабилизировать люмен с мембраной и submembraneous Цитоскелет апикальной характера. Выделительной ячейки расширяет его длина около 2 000 раз для создания этих каналов, делая эта модель уникальной в естественных условиях оценки de novo поляризованной мембраны биогенеза, внутриклеточный люмен морфогенеза и одноклеточные tubulogenesis. Протокола, представленные здесь показано, как объединить стандарта маркировки, выгоды и потери из функцию – генетических или РНК-интерференции (RNAi)-и микроскопический подходы использовать эту модель для визуально анализировать и функционально анализа этих процессов на молекулярном уровне. Как пример маркировки подхода Протоколе излагаются поколения трансгенных животных с флуоресцентные синтез белков для живой анализа tubulogenesis. Как пример генетического подхода в нем освещаются ключевые моменты визуальный РНК-интерференции на основе взаимодействия экран предназначен для изменения фенотипа кистозных канал усиления функции. Конкретные методы, описанные в как: ярлык и визуализировать каналов, выражая флуоресцентных белков; построить библиотеку целевых RNAi и выработать стратегию RNAi скрининг для молекулярного анализа канал морфогенеза; визуально оценить изменения канала фенотипов; Оценка их путем рассечения микроскопии флуоресцирования; характеризуют канал субцеллюлярные компоненты с более высоким разрешением, confocal микроскопии; и количественно визуальных параметров. Этот подход полезен для следователя, кто заинтересован в использовании преимуществ в C. elegans выделительной канал для выявления и классификации генов, участвующих в филогенетически сохранены процессах внутриклеточного просвета и одноклеточные трубка морфогенеза.

Introduction

Все внутренние органы состоят из трубок, решающее значение для их много разных функций, таких как транспорта и обмен газов, жидкостей и питательных веществ и выведение метаболических отходов. Их поляризованный характер, с собственный апикальной и lumenal мембраны, приспособлен для этих конкретных функций, и дефекты в биогенеза их систем эндо – и плазматической мембраны являются частой причиной человеческих болезней^1,2. Большинство трубок сосудистую и внутренних органов многоклеточных и формируют просвет intercellularly; Однако одноклеточными трубок, которые формируют просвета внутриклеточно, можно например, представляют столько, сколько 30 – 50% человеческого капиллярные кровати². Поляризованной мембраны multi – и одноклеточные трубы похожи в составе, хотя их microdomains могут различаться в зависимости от трубки определенной функции (например, выделительной канал канальцев против кишечных микроворсинки в Caenorhabditis Элеганс; сопроводительный документ на кишечные нематоды Caenorhabditis elegans tubulogenesis см)³. Среди размером сохраняются принципы биогенеза поляризованной мембраны и tubulogenesis, и подобные молекулярные машины направляет их^1,2,4.

C. elegans выделительной системы состоит из пяти ячеек: выделительной клеток (EC), проток клетки (DC), поры клеток (PC) и две железы клетки. Аблация EC, DC или PC приводит к накоплению жидкости в полости тела и животные умирают в начале личиночной стадии⁵. Интригующе, эти три одноклеточными трубки создать их люмен тремя различными способами: клеткой раздалбывают (EC); ячейки обертывания в сочетании с autocellular стыке формирования (PC); и путем обмотки клеток в сочетании с autofusion (DC); различные механизмы люмен морфогенеза, которые являются все филогенетически сохраняется^6,7. EC, расположенный на левой боковой стороне задней глотки колбы, отправляет два боковых расширений из которых четыре каналов разветвляются продлить кпереди и кзади (на правой и левой стороне) в кончик носа червя и хвост , соответственно (рис. 1)^5,6,8. ЕК простирается от примерно 1 мкм 2 x 1000 мкм, что делает его крупнейшим ячейки в животное. На субклеточном уровне выделительной канал представляет собой простой трубку, созданный из базальной мембраны направлена на pseudocoelom и туннель lumenal мембраны (endotube). Канал lumenal мембраны подключается воздуховод lumenal мембраны на его только межклеточные соединения; в противном случае каналы junctionless вдоль их длины (рис. 1). Lumenal мембрана выделительной канала и его submembraneous цитоскелета верхушечный, определяется их молекулярного состава, напоминающее состав апикальной мембраны и submembraneous цитоскелета многоклеточных трубок, как кишечник, и другие (например, плоские) эпителия. Цитоплазматических органелл, включая от англ везикулярный и другие (например, Гольджи) endomembranes распределяются по длине канала. Кроме того несколько канальцев везикулы – либо подключен к lumenal мембраны, взаимосвязаны или изолированные – являются многопоточными через канал цитоплазме^7,8,9,10 . Это динамическое подключение плазмы мембраны/канальцев далее расширяет канал мембранной системы и способствует как люмен морфогенеза и осморегуляция¹⁰. Выделительной канал таким образом почти полностью состоит из эндо – и плазменных мембран, обеспечивая отличную модель для анализа биогенеза поляризованной мембраны и регулирование Эндо-интерфейсу плазматической мембраны. Резкое расширение апикальной мембраны в ходе морфогенеза канал – в этой системе одноклеточных совпадающих с расширением люмен – также позволяет анализировать архитектурных проблем необходимость стабилизации и центра внутриклеточного lumenal мембрана . Этот протокол сосредоточена на анализе канала трубки и Люмене в структурной морфогенеза и внутриклеточные мембраны динамика, необходимые для этого процесса, а не на сигналы, которые направляют ячейки движения, которые генерируют позиции ЕС в выделительной системы и построить его сложные соединения другие клеточные элементы (обзор в⁶).

Еще одним преимуществом C. elegans одноклеточных канал системы для анализа поляризованной мембраны и внутриклеточных люмен биогенеза является его способность отделить, путем развития время поколения различных компонентов своих мембран и развязок. ЕК рождается во время закрытия брюшной и оседает Вентро боков глотки в середине эмбриогенеза^5,6,8, во время которого времени боковой канал расширение и ветвление возникают. Это сопровождается расширением передний задний канал во время позднего эмбриогенеза, процесс, который продолжается в L1-личиночной стадии (рис. 1). В только что вылупившихся личинок кончик заднего канала достигает примерно в середине червь, полностью расширения к хвосту в конце этапа L1, после чего канал удлиняется наряду с червь⁸. Рост активного канала со скоростью, превышающей животного роста таким образом заканчивается на первом личиночной стадии, однако, дальнейшего роста происходит параллельно с ростом всего животного в течение дополнительных личиночной стадии (L2-4). Этот параметр обеспечивает возможность анализировать различные шаги de novo поляризованной мембраны биогенеза независимо от поляризации деление клеток или миграции. Кроме того он допускает разделение этого процесса от Ассамблеи узлов (которые встречаются в эмбриона до инициации люмен); их точное требованием в поляризацию мембраны по-прежнему является открытым вопросом в области полярности. Наконец он однозначно отделяет апикальной от базальной мембраны экспансии, последний процесс, предшествующий бывший в выделительной каналов¹⁰. В C. elegans выделительной канал модель является поэтому особенно информативным дополнением к кишечной модель, которая разделяет ряд этих преимуществ для анализа биогенеза поляризованной мембраны, но выполняет его в многоклеточных обстановке (см. сопроводительный документ на кишечную tubulogenesis³).

Хотя одичал тип каналов ультратонких трубочки в этой крошечной червя, их люмен может быть visualized непосредственно на Номарски оптики в этой прозрачной животного. В самом деле морфологии мутант кистозных канал может быть охарактеризована в непомеченном животных, с использованием малое увеличение рассекает микроскопии, который был использован для большой эффект в вперед генетических экраны для идентификации генов, участвующих в tubulogenesis¹¹. Улучшенная визуализация морфология каналов и различия их поляризованной мембраны, цитоскелетных компонентов, различных внутриклеточных органелл и других внутриклеточных структур, однако, требует маркировки и выше мощность люминесцентных рассечения и конфокальная микроскопия. Хотя по каналам тонкой структуры создает ряд трудностей для маркировки и микроскопии, мембраны и субцеллюлярные компоненты можно выделить через конкретных молекул, уникальные для каждого отсека, и животные могут безопасно установлены для микроскопии, если меры предосторожности во избежание введения артефакты (см. протокол и обсуждение). Маркировка может быть сделано по иммуногистохимия в фиксированных образцов, или путем создания трансгенных червей, выражая флуоресцентные синтез белков под их собственным контролем или выделительной промоутеров канал специфичные для изображений в естественных условиях . Этот протокол описывает последний метод маркировки (см. сопроводительный документ на кишечную tubulogenesis для антитело пятная³).

Способность сочетать в vivo исследований или получить из функция потерь с в vivo imaging анализ на одну ячейку уровень на протяжении всего развития делает в C. elegans выделительной канал особенно строгую модель для молекулярных и Сотовый анализ одноклеточные tubulogenesis. Прямого или обратного генетического экраны могут быть выполнены начиная с одичал тип или помечены трансгенных животных, чтобы определить канал морфогенеза фенотипов (например, кисты) и их основные дефекты гена. Кроме того такие экраны можно начать с мутант фенотип (например, кистозный канал) и идентифицировать Подавители или усилители этот фенотип для идентификации генов, которые функционально взаимодействуют с геном, вызывая фенотипом мутанта. Может вызвать генетический дефект, вызывая фенотипом мутанта прибыли или убытка (например, через удаление ген) (например, через активирующих мутаций или через введение избыточного гена копий) исследуемой функции. Вперед, мутагенеза или систематического RNAi экраны без предубеждений на функции гена и объективной идентификации генов, вовлеченных в функции интерес. Учитывая наличие генома общесистемной RNAi кормления библиотек почти каждый ген может быть легко сбит RNAi в C. elegans, таким образом, что любой одного гена интереса или любой группы генов (например, в целевых экраны) могут также быть быстро исследован для их эффекта обратной генетики подход. Чтобы продемонстрировать возможно сочетание подходов, мы здесь описать целевой экран взаимодействия РНК-интерференции, начиная с кистозным выделительной канал усиления функции мутант, помечены цитоплазматических канал зеленого флуоресцентного белка (ГПУП). Мутант фенотип порожденных гиперэкспрессия erm-1, высоко сохранены C. elegans ortholog мембраны актина компоновщика семьи Эзрин-Radixin-Moesin (ERM), который был вовлечен в просвете морфогенеза и мембраны Организация в многих видов¹². C. elegans ERM-1 локализуется в lumenal мембраны внутренних органов, например выделительной канал и кишечника и необходим для формирования Люмене в обоих¹³. ERM-1 гиперэкспрессия новобранцев избыток актина и везикулы канал lumenal мембраны, увеличение потока в просвет и генерации короткий кистозных канал и гофрированные lumenal мембраны с утолщенными актина подшерсток⁹. Протокол описывает способы создания трансгенных штаммы с выделительной выразил канал помечены синтез белков (или другие белки); как выполнить целевые RNAi экраны, начиная с таких штаммов, определить модификаторы канал фенотип; и как визуально анализировать результаты таких экранов путем рассечения и конфокальной микроскопии флуоресцирования, включая простые способы для количественного определения информативный tubulogenesis фенотипов. Альтернативные методы и детали интерференции, часто смертельным tubulogenesis генов, с учетом можно найти в сопроводительный документ на кишечную tubulogenesis³. Все методы могут использоваться в различных сочетаниях для расследования других вопросов на канал tubulogenesis.

Protocol

1. Маркировка на канал Excretory C. elegans флуоресцентные белки Fusion 14 Примечание: увидеть сопроводительный документ на кишечную tubulogenesis 3 для маркировки в situ антитело пятная процедуры адаптации в выделительной канал. Таблица 1 пример?…

Representative Results

Этот протокол описывает, как использовать C. elegans выделительной каналов для визуально и молекулярно анализа одноклеточные tubulogenesis и внутриклеточных люмен морфогенеза в одну ячейку. Во время их расширение с момента середине эмбриогенеза к взрослой жизни четыре вы?…

Discussion

C. elegans генетических универсальность, прозрачности, план простой тела и инвариантные клеток линии делают отличную модель для анализа морфогенеза. Этот протокол описывает как сочетать стандартные генетических манипуляций и томографии исследования воспользоваться 2 микрон тонкие <…

Materials

Cloning
Plasmid pPD95.75	Addgene	Cat. No. 37464
PCR Kit	Qiagen	Cat. No. 27106
Ligation kit	New England Biolabs	Cat. No. E2611L
DNA marker	Thermo Scientific	Cat. No. SM1331
Agarose DNA grade	Fisher Scientific	Cat. No. BP164-100
Competent cells	New England Biolabs	Cat. No. C2987H
Tris	Fisher Scientific	Cat. No. BP154-1
EDTA	Sigma	Cat. No. ED-1KG
Acetic acid	Fisher Scientific	Cat. No. A38S-500
Ethidium bromide	Fisher Scientific	Cat. No. BP1302-10
Equipments
PCR machine	MJ Research	Cat. No. PTG-200
Centrifuge	Eppendorf	Cat. No. 5415C
Water Bath	Precision Scientific	Cat. No. 666A3
Gel running instrument	Fisher Scientific	Cat. No. 09-528-165
Gel running power supply	Fisher Scientific	Cat. No. 45-000-465
Molecular Imager Gel Doc XR System	Bio-Rad	Cat. No. 1708195EDU
Nanodrop Spectrophotometer	Thermo Scientific	Cat. No. ND1000
C. elegans related1			1see reference27 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates2			2see reference24 for protocols.
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Yeast Extract	BD Biosciences	Cat. no. 212750
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
Ampicillin	Sigma	Cat. no. A0116
Tetracycline	Fisher Scientific	Cat. no. BP912
M9 Medium2					2see reference24 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
Na2HPO4	Sigma	Cat. no. S7907
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
NGM plates 2			2see reference24 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Peptone	BD Biosciences	Cat. no. 211677
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
CaCl2	Sigma	Cat. no. C3881
Cholesterol	Sigma	Cat. no. C8667
K2HPO4	Sigma	Cat. no. P3786
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
RNAi plates3			3see reference60 for protocols.
NaCl	Sigma	Cat. no. S7653
Peptone	BD Biosciences	Cat. no. 211677
Tryptone	Acros Organics	Cat. no. 611845000
Bacto Agar	BD Biosciences	Cat. no. 214040
MgSO4	Sigma	Cat. no. M2773
CaCl2	Sigma	Cat. no. C3881
Cholesterol	Sigma	Cat. no. C8667
K2HPO4	Sigma	Cat. no. P3786
KH2PO4	Sigma	Cat. no. P0662
IPTG	US Biological	Cat. no. I8500
Carbenicillin	Fisher Scientific	Cat. no. BP2648
NaOH	Fisher Scientific	Cat. no. SS266-1
Sodium hypochlorite	Fisher Scientific	Cat. no. 50371500
Bacteria
OP50 bacteria	CGC
HT115 bacteria	CGC
Genome-wide RNAi libraries
Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref29,49)	Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref50)	Source BioScience
Imaging related
Lidocaine	MP Biomedicals,LLG	Cat. no. 193917
Materials
Vacuum Grease Silicone	Beckman	Cat. no. 335148
Microscope slides	Fisher Scientific	Cat. no. 4448
Microscope coverslips (22×22-1）	Fisher Scientific	Cat. no. 12-542-B
Tissue culture plate, 6 well	Corning Inc.	Cat. no. 08-772-33
Equipment
SMZ-U dissecting microscope (Nikon)
SZX12 dissecting microscope (Olympus), equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions).
TCS SL Laser-scanning confocal microscope (Leica Microsystem)
C2 laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope (Nikon)