Поколение и долгосрочное содержание без нервов<em> Hydra</em
Summary
Через двойное лечение колхицином может образоваться токсин, полученный из растений, который убивает делящиеся клетки, без нервов Hydra vulgaris . Эти Hydra не могут кормить или egest самостоятельно. В этой статье описывается улучшенный метод долгосрочного поддержания безрецидивной Hydra vulgaris в лаборатории.
Abstract
Интерстициальная клеточная линия Hydra включает в себя мультипотентные стволовые клетки и их производные: клетки железы, нематоциты, зародышевые клетки и нервные клетки. Интерстициальные клетки можно устранить с помощью двух последовательных обработок колхицином, производным токсином, который убивает делящиеся клетки, тем самым стирая потенциал для обновления дифференцированных клеток, которые получены из интерстициальных стволовых клеток. Это позволяет генерировать Hydra , у которых нет нервных клеток. Нервный полип не может открыть рот для кормления, egest или регулировать осмотическое давление. Однако такие животные могут выживать и размножаться на неопределенный срок в лаборатории, если их регулярно кормят и отрывают. Отсутствие нервных клеток позволяет изучать роль нервной системы в регулировании поведения и регенерации животных. Ранее опубликованные протоколы для поддержания работоспособности Hydra без нервов включали устаревшие методы, такие как пипетирование рта с помощью микропипетки с ручным приводом tIps для подачи и очистки Hydra . Здесь вводится улучшенный протокол для поддержания нервной системы Hydra . Щипцы с тонким наконечником используются, чтобы открыть рот и вставить недавно убитую Артемию . После принудительной подачи полость тела животного смывается свежей средой с помощью шприца и подкожной иглы для удаления непереваренного материала, называемого здесь «отрыжкой». Этот новый метод принудительного кормления и отрыжка нервной системы Hydra благодаря использованию щипцов и шприцев устраняет необходимость в пипетке для рта с помощью ручных наконечников микропипетки. Это делает процесс более безопасным и значительно более эффективным по времени. Чтобы исключить удаление нервных клеток в гипостоме, проводится иммуногистохимия с использованием антитирозинбукулина.
Introduction
Нервная система Hydra состоит из нервной сетки с нейронами, связанными с обоими эпителиальными тканевыми слоями 1 . Нервная сеть плотнее в гипостоме и цветоносе и менее плотная в колонке 2 тела. Нервные клетки происходят из интерстициальных стволовых клеток, которые являются мультипотентными стволовыми клетками, которые приводят к секреторным клеткам, нематоцитам, зародышевым клеткам и нейронам 1 . Можно исключить интерстициальные клетки Hydra vulgaris путем лечения колхицином 3 , 4 , производным токсином, который убивает делящиеся клетки. Хотя обнаружено, что колхицин ингибирует полимеризацию микротрубочек у других организмов, предыдущее исследование показало, что микротрубочки присутствуют в Hydra на протяжении всего лечения, что указывает на то, что колхицин не действует таким образом в Hydra 3 . Еще однаUdy предполагает, что колхицин не эффективно связывается с тубулином в некоторых организмах, включая Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas и Schizosaccharomyces pombe, что может объяснить эту разницу 5 . Обработка колхицином индуцирует фагоцитоз интерстициальных клеток эндодермальными эпителиальными клетками 3 и, таким образом, позволяет создавать животных, которым не хватает нервных клеток, клеток железы и нематоцитов. Неясно, почему интерстициальные клетки особенно восприимчивы к лечению колхицином. Учитывая, что как постмитотические интерстициальные клетки, так и линия интерстициальных стволовых клеток повреждены и фагоцитированы, Кэмпбелл пришел к выводу, что колхицин не оказывает непосредственного влияния на митотическую активность 3 . Примечательно, что обработка колхицином хорошо работает в Hydra vulgaris, но, как было показано, не работает также и у других видов, таких как Hydra oligactis 6 . </Em> Модифицированная обработка колхицином и гидроксимочевиной может быть использована для получения безрецидивной Hydra viridis 7 . Таким образом, безрецидивная гидра (также иногда называемая «эпителиальная гидра » 8 ) является полезным инструментом для изучения ролей этих специализированных типов клеток из линии междоузельных клеток в тканевом гомеостазе и регенерации.
Гидра может быть единственным известным примером животного, способного жить без нервной системы. Нервная гидра служит особенно полезной моделью для исследования роли нервной сети в регуляции регенерации Гидры , гомеостаза и поведения. Например, введение интерстициальных клеток в нервную гидру посредством трансплантации позволило характеризовать дифференцировку нервных клеток как специфическую для региона 9 . Кроме того, поскольку безрецидивная гидра может восстанавливаться, ониПозволяют исследовать альтернативные, не зависящие от нервной системы пути регенерации. Одним из таких примеров является апикальный нейрогенез и формирование головы, который, как было показано, зависит от функции cnox-2 в нервной системе у дикого типа Hydra , но, по-видимому, он не доступен в безрецидивной Hydra , что указывает на возможность альтернативного процесса регенерации головы 10 .
Нервная гидра также использовалась для изучения экспрессии эпителиальных клеток и регуляции нейрогенных и нейротрансмиссионных генов после потери нейрогенеза 11 . Нервируемая гидра не проявляет спонтанных спазмов 12 , что указывает на то, что эти всплески регулируются нервной системой. Гибридные нервы , однако, сокращаются в ответ на ущемление колонны тела с помощью щипцов, что указывает на то, что сокращение в ответ на механические раздражители опосредуется сочетаниемGh в эпителиальных клетках, тогда как спонтанное сократительное поведение опосредуется путем связывания через щелевые соединения в нервных клетках 13 .
Гидра без нервов не открывают рот, когда они снабжаются пищей или уменьшенным глутатионом 3 , что указывает на то, что сенсорные нейроны необходимы для обнаружения присутствия пищи и сигнала, чтобы открыть рот. Кроме того, нервная сеть, по-видимому, играет определенную роль в определении осмотического давления, поскольку животные без нервов неспособны автономно регулировать свое внутреннее гидростатическое давление через отверстие рта, вызывая их характерный вид, похожий на баллон 3 , 4 ( рисунок 1B ). Регулирование гидростатического давления в безрецидивной гидре при частой ручной дефляции приводило к потере некоторой аномальной морфологии в столбце гипостомы и тела. Однако хроническая дефляция привела к вмешательству в рост, elОрганизация, почкование и организация тканей 8 .
Хотя безрецидивная гидра неспособна самостоятельно кормить и самостоятельно, ее можно поддерживать в течение неопределенного времени в лаборатории путем принудительного кормления и отрыжка каждого животного. В предыдущих публикациях были описаны методы принудительного кормления и отрывания нервной системы Hydra , однако в этих протоколах использовались наконечники микропипетки, которые необходимо осторожно вытащить вручную до соответствующего размера, а также использовать мундштук, соединенный с пипеткой трубкой 14 . Здесь описан более простой, безопасный и более эффективный по времени метод кормления и отрыжка.
Кроме того, предыдущие исследования включали проверку отсутствия нервных клеток путем диссоциации фиксированных животных в отдельные клетки и исследование морфологии клеток 3 , 4 , 15 . ЧАСКроме того, иммуногистохимия с моноклональным антителом против тирозинированного карбоксильного конца альфа-тубулина использовалась в качестве бесплатного метода для мацерации для проверки истощения нейронов в гипостоме 13 , 16 . Предыдущие исследования показали, что нейроны в цветоносе могут также визуализироваться с использованием этого антитела 13 , однако эти нейроны, а также те, которые находятся в колонке тела, сложнее выявить. Хотя иммуногистохимия достаточна для подтверждения отсутствия нервных клеток в гипостоме и не требует опыта по морфологии клеточного типа, ее нельзя использовать для проверки отсутствия интерстициальных стволовых клеток и других производных этих клеток. Исследования диссоциации и клеточной морфологии более строги и могут дать количественный отчет о количестве каждого типа клеток, оставшихся после каждого этапа лечения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Гистидные интерстициальные клетки могут быть устранены с помощью двойной обработки колхицином 3 , 4 . В дни, следующие за первой обработкой, крайне важно предотвратить контакт между отдельными Hydra, чтобы избежать слияния кусков Hydra в деформи…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарны д-ру Дику Кэмпбеллу (UC Irvine) за обсуждения первоначального протокола для создания и поддержки животных, свободных от нервов, г-жу Руи Ван за помощь в адаптации техники шприца и иглы, и г-жа Даниэль Хагстром и д-р Роб Стил (UC Irvine) для комментариев к рукописи. Эта работа была поддержана грантом RCSA и NSF CMMI-1463572.
Materials
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 ml Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X – 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 ml Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
References
- Bode, H. R. The interstitial cell lineage of Hydra: a stem cell system that arose early in evolution. J. Cell. Sci. 109, 1155-1164 (1996).
- Hager, G., David, C. N. Pattern of differentiated nerve cells in hydra is determined by precursor migration. Development. 124, 569-576 (1997).
- Campbell, R. D. Elimination of Hydra interstitial and nerve cells by means of colchicine. J. Cell. Sci. 21, 1-13 (1976).
- Marcum, B. A., Campbell, R. D. Development of Hydra lacking nerve and interstitial cells. J. Cell. Sci. 29, 17-33 (1978).
- Burns, R. G. 3H-colchicine binding: Failure to detect any binding to soluble proteins from various lower organisms. Exp. Cell. Res. 81, 285-292 (1973).
- Lee, H. -. T., Campbell, R. D. Development and Behavior of an Intergeneric Chimera of Hydra (Pelmatohydra oligactis Interstitial Cells Hydra attenuata Epithelial Cells). Biol. Bull. 157 (2), 288-296 (1979).
- Novak, P. Preparing Hydra viridis with Nerve Cells and No Interstitial Cells, or with Neither of These Cell Types. Hydra: Research Methods. , 295-297 (1983).
- Wanek, N., Marcum, B. A., Lee, H. -. T., Chow, M., Campbell, R. D. Effect of hydrostatic pressure on morphogenesis in nerve-free Hydra. J. Exp. Zool. 211, 275-280 (1980).
- Minobe, S., Koizumi, O., Sugiyama, T. Nerve cell differentiation in nerve-free tissue of epithelial Hydra from precursor cells introduced by grafting. Dev. Biol. 172 (1), 170-181 (1995).
- Miljkovic-Licina, M., Chera, S., Ghila, L., Galliot, B. Head regeneration in wild-type hydra requires de novo neurogenesis. Development. 134 (6), 1191-1201 (2007).
- Wenger, Y., Buzgariu, W., Galliot, B. Loss of neurogenesis in Hydra leads to compensatory regulation of neurogenic and neurotransmission genes in epithelial cells. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (20150040), (2015).
- Campbell, R. D., Josephson, R. K., Schwab, W. E., Rushforth, N. B. Excitability of nerve-free Hydra. Nature. 262, 388-390 (1976).
- Takaku, Y., Hwang, J. S., et al. Innexin gap junctions in nerve cells coordinate spontaneous contractile behavior in Hydra polyps. Sci. Rep. 4 (3573), (2014).
- Marcum, B. A. Culturing Epithelial Hydra. Hydra: Research Methods. , 287-290 (1983).
- David, C. N. A quantitative method for maceration of Hydra tissue. Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 171, 259-268 (1973).
- Gröger, H., Schmid, V. Larval development in Cnidaria: A connection to Bilateria. Genesis. 29 (3), 110-114 (2001).
- Lenhoff, H. M. Water, Culture Solutions, and Buffers. Hydra: Research Methods. , 29-34 (1983).
- Shenk, M. A., Bode, H. R., Steele, R. E. Expression of Cnox-2, a HOM/HOX homeobox gene in hydra, is correlated with axial pattern formation. Development. 117, 657-667 (1993).
- Böttger, A., et al. Horizontal Gene Transfer Contributed to the Evolution of Extracellular Surface Structures: The Freshwater Polyp Hydra Is Covered by a Complex Fibrous Cuticle Containing Glycosaminoglycans and Proteins of the PPOD and SWT (Sweet Tooth) Families. PLoS One. 7 (12), (2012).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Dev. Biol. 13 (8), (2013).
