无神经的一代和长期维持<em>水润</em
Summary
通过秋水仙碱的双重治疗，可以产生一种杀死分裂细胞的植物来源的毒素，可以产生无神经的九头蛇 。这些九头蛇不能自己饲养或觅食。本文介绍了实验室中长期维持无神经寻常性黑 。 病的改进方法。
Abstract
Hydra的间质细胞谱系包括多能干细胞及其衍生物：腺体细胞，线粒体细胞，生殖细胞和神经细胞。间歇细胞可以通过两次连续的处理来消除，秋水仙素是一种植物来源的毒素，其杀死分裂细胞，从而消除了从间质干细胞衍生的分化细胞的更新潜力。这样可以产生缺乏神经细胞的九头蛇 。无神经的息肉不能打开嘴巴进食，最小化或调节渗透压。然而，如果经常强制喂养和褥疮，这样的动物可以在实验室中无限期地存活和培养。神经细胞的缺乏允许研究神经系统在调节动物行为和再生中的作用。以前发布的无神经性Hydra维持方案涉及过时的技术，例如用手拉式微量移液管吸嘴ips喂养和清洁九头蛇 。在这里，介绍了一种用于维持无神经的Hydra的改进方案。精细的镊子用于强制开口并插入新鲜杀死的卤虫 。在强制喂养之后，使用注射器和皮下注射针将动物的体腔用新鲜培养基冲洗以除去未被消化的材料，这里称为“打嗝”。通过使用镊子和注射器，这种通过使用镊子和注射器的强制喂养和打嗝无神经的九头蛇的新方法消除了使用手拉式微量吸头的吸嘴的需要。因此使得该过程更加安全和显着地更加高效。为了确保hypostome中的神经细胞已被消除，使用抗酪氨酸 – 微管蛋白进行免疫组织化学。
Introduction
九头蛇神经系统由神经网组成，神经元与上皮组织层1相关联。神经网在体积较小的密集体和花序梗中较密集，体积不足2 。神经细胞来自间质干细胞，这是造成分泌细胞，神经细胞，生殖细胞和神经元的多能干细胞。可以通过用秋水仙素3,4 （一种杀死分裂细胞的植物来源的毒素）处理来消除寻常性黑草的间质细胞。尽管秋水仙碱已被发现抑制其他生物体中的微管聚合，但以前的研究表明，在整个治疗过程中， Hydra存在微管，这表明秋水仙素在Hydra 3中不起作用。另一个udy表示秋水仙素在一些生物体中不能有效地结合微管蛋白，包括四膜虫，三角豆，衣藻和粟酒裂殖酵母，这可能解释了这种差异。秋水仙碱治疗通过内胚层上皮细胞3诱导间质细胞的吞噬，从而允许产生缺乏神经细胞，腺体细胞和神经细胞的动物。不清楚为什么间质细胞对秋水仙碱治疗特别敏感。鉴于有丝分裂后间质细胞和间质干细胞谱系都受损和吞噬，Campbell认为秋水仙素不直接影响有丝分裂活性3 。值得注意的是，秋水仙碱治疗在寻常 藿香中效果良好，但在其他物种如Hydra oligactis 6中也 表现不佳 。 </用秋水仙碱和羟基脲进行改良处理可用于产生无神经的水ra草 7 。因此，无神经的Hydra （有时也被称为“上皮Hydra ” 8 ）是研究来自间质细胞系的这些特殊细胞类型在组织稳态和再生中的作用的有用工具。
九头蛇可能是没有神经系统能够生活的动物的唯一已知的例子。无神经的九头蛇作为一种特别有用的模型，用于解剖神经网在调节Hydra再生，体内平衡和行为中的作用。例如，通过移植将间质细胞引入无神经的Hydra ，允许将神经细胞分化表征为高度区域特异性9 。此外，因为无神经的Hydra可以再生，它们可以调查替代的，神经系统独立的再生途径。一个这样的例子是顶端神经发生和头部形成，其已显示取决于野生型Hydra中神经系统中的cnox-2功能，但似乎在无神经的Hydra中是不必要的 ，这表明可能存在替代的头部再生过程10 。
神经发生丧失后，神经元和神经传递基因也被用于研究上皮细胞的表达和调节。无神经的九头蛇不会发生自发的收缩爆发12 ，表明这些爆发是由神经系统调节的。然而，无神经的水ra ra ，，in to to the the the force force u u u u u u u u u u u u u u u u u u ugh间隙连接在上皮细胞，而自发收缩行为介导通过间隙连接在神经细胞13 。
无神经的九头蛇在呈现食物或还原型谷胱甘肽3时不要张开嘴巴，这表明感觉神经元是检测食物存在所必需的，并且指示口腔开放。此外，神经网似乎在感测渗透压方面发挥作用，因为无神经动物不能通过开口自主调节其内部静水压力，导致其特征性的气球样外观3,4 （ 图1B ）。通过频繁的手动通气调节无神经的Hydra的静水压，导致hypostome和身体柱中的一些异常形态的损失。然而，长期通缩导致了对经济增长的干扰发病，萌芽和组织组织8 。
虽然无神经的九头蛇不能自己饲养和自发，但可以通过手动强制喂养和打击每只动物在实验室中无限期地保持它们。以前的出版物已经描述了强制喂养和打嗝无神经Hydra的方法 ，然而这些方案涉及使用微量移液器吸头，其必须被小心地手动地拉到适当的尺寸，以及使用通过管道14连接到移液管的接口管。这里描述了一种更简单，更安全，更节省时间的喂食和打嗝方法。
此外，以前的研究涉及通过将固定动物解离成单个细胞来检查神经细胞的缺失和细胞形态的检查3,4,15。 H使用抗α微管蛋白的酪氨酸羧基末端的单克隆抗体的免疫组织化学作为一种补充方法，用于检查hypostome 13,16中神经元的消耗。以前的研究已经表明，也可以使用这种抗体13可视化花序梗中的神经元，然而这些神经元以及体列中的这些神经元更难以形成。虽然免疫组织化学足以证实在hypostome中不存在神经细胞，并且不需要关于细胞类型形态的专门知识，但是它不能用于检查间质干细胞和这些细胞的其它衍生物的缺失。解离和细胞形态学研究更加严格，并且可以给出每个治疗阶段后剩余的每种细胞类型的数量的定量分析。
Protocol
Representative Results
Discussion
Hydra间质细胞可以通过双秋水仙碱治疗3,4消除。在第一次处理之后的几天内，防止个人Hydra之间的接触，以避免Hydra碎片融入变形Hydra中至关重要。此外，第一次治疗后可以不助食的动物必须去除，因为第二次秋水仙碱治疗可能不足以从这些动物中消除剩余的间质细胞。为了使第二次秋水仙碱治疗后无神经性九头蛇的存活率最大化，从第一次治疗?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢杜克坎贝尔博士（UC Irvine）就关于产生和维持无神经动物的原始方案进行讨论，王瑞女士帮助适应注射器和针头技术，Danielle Hagstrom女士和Rob Steele博士（加州大学欧文分校）对手稿发表评论。这项工作得到RCSA和NSF授权CMMI-1463572的支持。
Materials
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 ml Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X – 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 ml Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
References
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