דור ותחזוקה לטווח ארוך של עצבים ללא<em> הידרה</em
Summary
באמצעות טיפול כפול עם קולצ'יצין, רעלן הנגזרות מן הצמח הורג תאים מחולקים, הידרה ללא עצה הידראולית יכול להיות שנוצר. הידרה אלה לא יכולים להאכיל או egest בעצמם. מאמר זה מתאר שיטה משופרת עבור תחזוקה לטווח ארוך של העצב חינם הידרה vulgaris במעבדה.
Abstract
השושלת התא interstitial של הידרה כולל תאי גזע multipotent, ונגזרותיהם: תאי בלוטת, נמטוציטים, תאי נבט, ותאי עצב. תאים interstitial ניתן לבטל דרך שני טיפולים רצופים עם קולצ'יצין, רעלן הנגזרות מן הצמח כי הורג תאים מחולקים, ובכך מוחק את הפוטנציאל לחידוש של תאים מובחנים נגזרות תאי גזע interstitial. זה מאפשר את הדור של הידרה כי חוסר תאי עצב. פוליפ נטול עצבים אינו יכול לפתוח את פיו כדי להאכיל, לגדול, או להסדיר לחץ אוסמוטי. בעלי חיים כאלה, לעומת זאת, יכולים לשרוד ולהיות מתורבת ללא הגבלת זמן במעבדה אם באופן קבוע להאכיל בכוח ו גיהוק. היעדר תאי עצב מאפשר מחקרים על תפקידה של מערכת העצבים בוויסות התנהגות בעלי חיים והתחדשות. שפורסמו בעבר פרוטוקולים עבור תחזוקה ללא הידרה הידרה כרוך טכניקות מיושנות כגון פיפטינג פה עם יד משך micropipetteIps כדי להאכיל ולנקות את ההידרה . הנה, פרוטוקול משופר לתחזוקה של הידרה ללא עצב הוא הציג. מלקחיים עדינים משמשים לכפות לפתוח את הפה ולהכניס טריים Artemia נהרג. לאחר האכלה בכוח, חלל הגוף של החיה הוא סומק בינוני בינוני באמצעות מזרק ומחט מזרק כדי להסיר חומר מעוכל, המכונה כאן "גיהוק". שיטה חדשה זו של האכלה בכוח ו גיהוק ללא הידרה ללא שימוש במלקחיים ומזרקים מבטלת את הצורך בפה פיפטינג באמצעות משיכת יד micropipette עצות. זה ובכך הופך את התהליך בטוח יותר באופן משמעותי יותר זמן. כדי להבטיח כי תאי עצב hypostome בוטלו, אימונוהיסטוכימיה באמצעות אנטי tyrosine- טובולין מתנהל.
Introduction
מערכת העצבים של הידרה מורכבת של רשת עצבים, עם נוירונים הקשורים בשתי שכבות רקמה אפיתל 1 . רשת העצבים צפופה יותר בהיפוסטומה ובמחזור הדם ופחות צפופה בעמודה השנייה של הגוף. תאי העצבים מקורם בתאי גזע אינטרסטיציאליים, שהם תאי גזע רב-תכליתיים המביאים לתאים מפרידים, נמטוציטים, תאי נבט, ונוירונים. ניתן לחסל את התאים interstitial של הידרה vulgaris באמצעות טיפול עם colchicine 3 , 4 , נגזרות צמח נגזר כי הורג תאים מחולקים. למרות colchicine נמצא לעכב פילמור microtubule באורגניזמים אחרים, מחקר קודם הוכיח כי microtubules נוכחים בהידרה לאורך כל הטיפול, מה שמרמז כי קולכיצין לא מתנהג כך הידרה 3 . רחוב נוסףAudy מציע כי colchicine אינו נקשר ביעילות toulinin בכמה אורגניזמים, כולל Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas, ו Schizosaccharomyces pombe, אשר עשוי להסביר את ההבדל 5 . הטיפול קולצ'יצין גורם phagocytosis של תאים interstitial על ידי תאים אפיתלתיים endodermal 3 ובכך מאפשר את היצירה של בעלי חיים שחסרים תאים עצביים, תאי בלוטת, ו nematocytes. לא ברור מדוע התאים interstitial רגישים במיוחד לטיפול קולכיצין. בהתחשב בכך שתאי ביניים של פוסט-מיטוטי ותאי גזע של תאי גזע פגומים ופגוסיטוסים, קמפבל סיכם כי קולצ'יצין לא משפיע ישירות על פעילות מיטוטית. יש לציין כי הטיפול בקולכיצין פועל היטב בהידרה וולגריס, אך הוכח כי אינו פועל גם במינים אחרים, כגון הידרה אוליגקטוס 6 . </Em> טיפול שונה עם colchicine ו hydroxyurea ניתן להשתמש כדי לייצר עצבים ללא הידרה viridis 7 . ללא עצב הידרה (המכונה גם לעתים קרובות " הידרה אפיתל" 8 ) ולכן הם כלי שימושי ללמוד את התפקידים של סוגי תאים מיוחדים אלה מן השושלת תא interstitial בהומיאוסטזיס רקמות התחדשות.
הידרה עשויה להיות הדוגמה המוכרת היחידה של בעל חיים המסוגל לחיות ללא מערכת העצבים. העצבים ללא הידרה משמשים מודל שימושי במיוחד עבור לנתח את התפקיד של רשת העצבים בוויסות התחדשות הידרה , הומאוסטזיס, והתנהגות. לדוגמה, המבוא של תאים interstitial לתוך הידרה ללא עצב באמצעות השתלת מותר אפיון של התמיינות תאים עצביים כמו אזור ספציפי במיוחד 9 . יתר על כן, כי הידרה ללא עצב יכול להתחדש, הםלאפשר את החקירה של אלטרנטיבי, העצבים מערכת עצמאית התחדשות מסלולים. דוגמה אחת כזו היא neurogenesis apical ו היווצרות הראש, אשר הוכח להיות תלוי פונקציה cnox-2 במערכת העצבים wildtype הידרה , אבל נראה להיות ניתנת להסרה ב הידרה ללא עצבים, דבר המצביע על כך עשוי להיות חלופי ראש התחדשות התהליך 10 .
העצבים ללא הידרה שימשו גם כדי ללמוד ביטוי תא אפיתל תקנה של גנים neurogenic ו neurotransmission לאחר אובדן neurogenesis 11 . עצבים ללא הידרה אינם מציגים התפרצויות ספונטניות בהתכווצות 12 , מה שמראה כי התפרצויות אלה מוסדרים על ידי מערכת העצבים. העצבים ללא הידרה לעשות, עם זאת, חוזה בתגובה צביטה של עמודה הגוף עם מלקחיים, מה שמרמז כי התכווצות בתגובה לגירויים מכניים מתווכת על ידי צימוד throuצומת פערים בתאים אפיתל, בעוד התנהגות התכווצות ספונטנית מתווכת על ידי צימוד דרך צמתים הפער בתאי עצב 13 .
העצבים ללא הידרה לא לפתוח את הפה כאשר הציג עם מזון או מופחת גלוטתיון 3 , דבר המצביע על כך נוירונים חושית נחוצים כדי לזהות את הנוכחות של מזון לאות את הפה לפתוח. בנוסף, נראה כי רשת העצבים ממלאת תפקיד בחישה של לחץ אוסמוטי, מכיוון שחיות ללא עצב אינן מסוגלות לסדר באופן אוטומטי את הלחץ ההידרוסטטי הפנימי שלהן באמצעות פתיחת הפה, דבר הגורם להופעתן של בלון אופייני 3 , 4 ( איור 1 ב ' ). תקנה של לחץ הידרוסטטי ב הידרה ללא עצב על ידי דפלציה ידנית תכופים הובילה לאובדן של מורפולוגיה חריגה בעמודה hypostome ואת הגוף. עם זאת, דפלציה כרונית הובילה להפרעה לצמיחה, אלOngation, נבגי, ואת רקמת הארגון 8 .
למרות הידרה ללא עצבים אינם מסוגלים להאכיל ו egest על שלהם, אפשר לשמור אותם ללא הגבלה במעבדה על ידי ידני האכלה בכוח ו גיהוק כל בעל חיים. פרסומים קודמים תיארו שיטות של האכלה בכוח ו גיהוק הידרה ללא עצבים, אולם פרוטוקולים אלה מעורבים השימוש עצות micropipette כי חייב להיות מושך יד בזהירות לגודל המתאים, כמו גם שימוש של שפופרת מחובר פיפטה ידי צינורות 14 . הנה, שיטה פשוטה יותר, בטוחה יותר, זמן יעיל יותר של האכלה ו גיהוק מתואר.
בנוסף, מחקרים קודמים היו כרוכים בבדיקת היעדר תאי עצב באמצעות ניתוק של בעלי חיים קבועים לתאים בודדים ובדיקת מורפולוגיה של התא 3 , 4 , 15 . חאז, אימונוהיסטוכימיה עם נוגדן חד שבטי נגד carboxyl- tyrosinated מסוף של אלפא טובולין שימש כשיטה חינם כדי macation כדי לבדוק את דלדול של נוירונים ב hypostome 13 , 16 . מחקרים קודמים הראו כי נוירונים ב peduncle יכול גם להיות דמיינו באמצעות נוגדן זה 13 , אולם אלה נוירונים כמו גם אלה בעמודה הגוף קשה יותר לעשות. בעוד אימונוהיסטוכימיה מספיקה כדי לאשר את היעדר תאי עצב ב hypostome ואינו דורש מומחיות על סוג מורפולוגיה התא, זה לא יכול לשמש כדי לבדוק את היעדר תאי גזע interstitial ואת נגזרות אחרות של תאים אלה. דיסוציאציה ומחקרים מורפולוגיה תא הם קפדניים יותר והוא יכול לתת חשבון כמותי של המספרים של כל סוג התא שנותרו לאחר כל שלב של הטיפול.
Protocol
Representative Results
Discussion
הידרה interstitial תאים ניתן לבטל דרך טיפול קולצ'יצין פעמיים 3 , 4 . בימים שלאחר הטיפול הראשון, זה קריטי כדי למנוע מגע בין הידרה בודדים כדי למנוע היתוך של חלקים הידרה לתוך הידרה מעוות. כמו כן, בעלי חיים אשר יכולים לאכול ללא …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לד"ר דיק קמפבל (UC Irvine) לדיונים על הפרוטוקול המקורי להפקת ושמירה על בעלי חיים ללא עצבים, גב 'רוי וואנג על עזרה בהתאמת טכניקת המזרק והמחט, וגברת דניאלה הגסטרום וד"ר רוב סטיל (UC Irvine) להערות על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי RCSA ו- NSF מענק CMMI-1463572.
Materials
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 ml Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X – 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 ml Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
References
- Bode, H. R. The interstitial cell lineage of Hydra: a stem cell system that arose early in evolution. J. Cell. Sci. 109, 1155-1164 (1996).
- Hager, G., David, C. N. Pattern of differentiated nerve cells in hydra is determined by precursor migration. Development. 124, 569-576 (1997).
- Campbell, R. D. Elimination of Hydra interstitial and nerve cells by means of colchicine. J. Cell. Sci. 21, 1-13 (1976).
- Marcum, B. A., Campbell, R. D. Development of Hydra lacking nerve and interstitial cells. J. Cell. Sci. 29, 17-33 (1978).
- Burns, R. G. 3H-colchicine binding: Failure to detect any binding to soluble proteins from various lower organisms. Exp. Cell. Res. 81, 285-292 (1973).
- Lee, H. -. T., Campbell, R. D. Development and Behavior of an Intergeneric Chimera of Hydra (Pelmatohydra oligactis Interstitial Cells Hydra attenuata Epithelial Cells). Biol. Bull. 157 (2), 288-296 (1979).
- Novak, P. Preparing Hydra viridis with Nerve Cells and No Interstitial Cells, or with Neither of These Cell Types. Hydra: Research Methods. , 295-297 (1983).
- Wanek, N., Marcum, B. A., Lee, H. -. T., Chow, M., Campbell, R. D. Effect of hydrostatic pressure on morphogenesis in nerve-free Hydra. J. Exp. Zool. 211, 275-280 (1980).
- Minobe, S., Koizumi, O., Sugiyama, T. Nerve cell differentiation in nerve-free tissue of epithelial Hydra from precursor cells introduced by grafting. Dev. Biol. 172 (1), 170-181 (1995).
- Miljkovic-Licina, M., Chera, S., Ghila, L., Galliot, B. Head regeneration in wild-type hydra requires de novo neurogenesis. Development. 134 (6), 1191-1201 (2007).
- Wenger, Y., Buzgariu, W., Galliot, B. Loss of neurogenesis in Hydra leads to compensatory regulation of neurogenic and neurotransmission genes in epithelial cells. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (20150040), (2015).
- Campbell, R. D., Josephson, R. K., Schwab, W. E., Rushforth, N. B. Excitability of nerve-free Hydra. Nature. 262, 388-390 (1976).
- Takaku, Y., Hwang, J. S., et al. Innexin gap junctions in nerve cells coordinate spontaneous contractile behavior in Hydra polyps. Sci. Rep. 4 (3573), (2014).
- Marcum, B. A. Culturing Epithelial Hydra. Hydra: Research Methods. , 287-290 (1983).
- David, C. N. A quantitative method for maceration of Hydra tissue. Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 171, 259-268 (1973).
- Gröger, H., Schmid, V. Larval development in Cnidaria: A connection to Bilateria. Genesis. 29 (3), 110-114 (2001).
- Lenhoff, H. M. Water, Culture Solutions, and Buffers. Hydra: Research Methods. , 29-34 (1983).
- Shenk, M. A., Bode, H. R., Steele, R. E. Expression of Cnox-2, a HOM/HOX homeobox gene in hydra, is correlated with axial pattern formation. Development. 117, 657-667 (1993).
- Böttger, A., et al. Horizontal Gene Transfer Contributed to the Evolution of Extracellular Surface Structures: The Freshwater Polyp Hydra Is Covered by a Complex Fibrous Cuticle Containing Glycosaminoglycans and Proteins of the PPOD and SWT (Sweet Tooth) Families. PLoS One. 7 (12), (2012).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Dev. Biol. 13 (8), (2013).
