신경이없는 세대의 장기간 유지 관리<em> 히드라</em
Summary
colchicine을 이용한 이중 처리를 통해 분열 세포를 죽이는 식물 유래 독소, 신경이없는 히드라 vulgaris 가 생성 될 수 있습니다. 이 히드라 는 독자적으로 먹거나 먹을 수 없습니다. 이 논문은 실험실에서 신경이없는 히드라 vulgaris 의 장기 유지를위한 개선 된 방법을 설명합니다.
Abstract
히드라 의 간질 세포 계통에는 다 분화능 줄기 세포와 그 파생물이 포함됩니다 : 샘 세포, 혈구 세포, 배아 세포 및 신경 세포. 간질 세포는 분열 세포를 죽이는 식물 유래 독소 인 콜히친 (collicicine)을 2 회 연속 처리하여 제거함으로써 간질 줄기 세포에서 유래 한 분화 세포의 재생 가능성을 없앨 수 있습니다. 이것은 신경 세포가 부족한 히드라 의 생성을 가능하게합니다. 신경이없는 폴립은 삼투압을 공급, 제거 또는 조절하기 위해 입을 열 수 없습니다. 그러나 그러한 동물은 규칙적으로 강제로 먹이를 먹이고 짐을 싣기 만하면 생존하고 실험실에서 무기한 배양 될 수 있습니다. 신경 세포가 부족하여 동물 행동과 재생을 조절하는 신경계의 역할을 연구 할 수 있습니다. 신경이없는 히드라 유지를 위해 이전에 발표 된 프로토콜에는 손으로 뽑은 마이크로 피펫을 사용한 구강 (mouth-pipetting)히드라 를 먹이고 닦으십시오. 여기서 신경이없는 히드라 유지를위한 개선 된 프로토콜이 소개됩니다. 잘게 썰린 집게는 강제로 입을 열고 갓 죽인 아르테 미아 (Artemia)를 삽입하는 데 사용됩니다. 강제 공급 후 동물의 체강을 시린지와 피하 주사침을 사용하여 신선한 배지로 씻어내어 소화되지 않은 물질을 제거합니다. 여기서는 "burping"이라고합니다. 포셉과 주사기를 사용하여 힘을 공급하고 신경이없는 히드라 를 버핑하는이 새로운 방법은 손으로 뽑은 마이크로 피펫 팁을 사용하는 입 피펫팅의 필요성을 없애줍니다. 따라서 프로세스를보다 안전하고 훨씬 더 효율적으로 만듭니다. hypostome의 신경 세포가 제거되었는지 확인하기 위해 anti-tyrosine-tubulin을 이용한 면역 조직 화학 법을 시행합니다.
Introduction
히드라 의 신경계는 상피 조직층과 관련된 뉴런과 함께 신경 네트로 구성됩니다 1 . 신경망은 hypostome과 peduncle에서 밀도가 높고 body 칼럼 2 에서는 밀도가 낮습니다. 신경 세포는 분비 세포, 혈구 세포, 배아 세포 및 뉴런을 생성하는 다 능성 줄기 세포 인 간질 줄기 세포에서 기원합니다 1 . 분열 된 세포를 죽이는 식물 유래 독소 인 콜히친 3 , 4로 처리하여 히드라 분비 선의 간질 세포를 제거 할 수 있습니다. colchicine이 다른 유기체에서 미세 소관의 중합을 억제하는 것으로 밝혀졌지만, 이전의 연구에 따르면 microtubules은 Hydra 3 에서 전체적으로 콜히친이 이런 작용을하지 않는다는 것을 시사하는 전체 치료 과정에서 Hydra 에 존재한다는 사실이 밝혀졌습니다. 또 다른 성udy는 Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas 및 Schizosaccharomyces pombe를 포함한 일부 유기체에서 콜히친이 tubulin에 효율적으로 결합하지 않는다고 제안하는데 , 이는이 차이를 설명 할 수있다. 콜히친 치료는 내배엽 상피 세포에 의한 간질 세포의 식균 작용을 유도하므로 신경 세포, 간 세포 및 혈구 세포가 결핍 된 동물을 만들 수 있습니다. 간질 세포가 콜히친 치료에 특히 민감한 이유는 분명하지 않습니다. 사후 mitotic interstitial cell과 interstitial stem cell lineage가 모두 손상되고 탐식 된 것을 감안할 때, Campbell은 콜히친이 유사 분열 활성에 직접적으로 영향을 미치지 않는다고 결론 지었다 3 . 특히, 콜히친 치료는 히드라 vulgaris 에서 잘 작동하지만 Hydra oligactis 6 와 같은 다른 종에서는 효과가없는 것으로 나타났습니다 . </colchicine과 hydroxyurea로 변형 된 치료는 신경이없는 Hydra viridis 7 을 생산하는데 사용될 수 있습니다. 신경이없는 히드라 (때로는 "상피 히드라 "라고도 함)는 조직 항상성과 재생에서 간질 세포 계통에서 이러한 특수 세포 유형의 역할을 연구하는 데 유용한 도구입니다.
히드라 는 신경계없이 살 수있는 동물의 유일한 예일 수 있습니다. 신경이없는 히드라 는 히드라 재생, 항상성 및 행동을 조절하는 신경 망의 역할을 분석하는 데 특히 유용한 모델입니다. 예를 들어, 간질 세포를 이식을 통한 신경없는 히드라 로 도입하면 신경 세포 분화의 특성을 고도의 부위 특이 적 특성으로 인정할 수 있었다. 또한, 신경이없는 히드라 가 재생할 수 있기 때문에, 그들은대안적이고 신경계에 독립적 인 재생 경로를 조사 할 수 있습니다. 하나의 그러한 예는 apical neurogenesis와 head formation이며, 이것은 wild type Hydra 의 신경계에서 cnox-2 기능에 의존하는 것으로 나타 났지만, 신경이없는 Hydra 에는 필요하지 않은 것처럼 보이며, 대체 머리 재생 과정이있을 수 있음을 시사한다 10 .
신경이없는 히드라 는 또한 신경 발생을 상실한 후에 신경 세포와 신경 전달 유전자의 상피 세포 발현과 조절을 연구하는데 사용되어왔다. 신경이없는 히드라 는 자발적인 수축 버스트 12를 나타내지 않으며, 이는 이러한 버스트가 신경계에 의해 조절된다는 것을 나타냅니다. 그러나 신경이없는 히드라 는 신체 칼럼을 집게로 꼬집는 것에 반응하여 기계적 자극에 반응하는 수축이 커플 링에 의해 매개되는 것으로 나타났습니다gh 갭 접합부를 형성하는 반면, 자연적 수축 작용은 신경 세포의 갭 접합부를 통해 커플 링 됨으로써 매개된다.
신경이없는 히드라 는 음식이나 감칠맛이있는 글루타티온 3을 선물로 먹었을 때 입을 열지 않아 음식의 존재를 감지하고 입을 열어야한다는 감각 뉴런이 필요합니다. 또한, 신경이없는 동물은 입안을 통해 내부 정압을 자율적으로 조절할 수 없기 때문에 삼투압을 감지하는 역할을하는 것으로 보이며, 풍선 모양과 같은 모양을 띄게됩니다 ( 그림 1B ). 신경 수분이없는 히드라 의 수압을 수동으로 수축 시켜서 수압을 조절하면 hypostome과 body column의 비정상적인 형태가 손실됩니다. 그러나 만성적 인 디플레이션은 성장에 대한 간섭으로 이어졌다.구성, 출생 및 조직 구성 8 .
신경이없는 히드라 는 스스로 먹일 수는 없지만 실험실에서 각 동물을 수동으로 강제로 먹이고 버핑하여 무한히 유지할 수 있습니다. 이전의 간행물은 힘을 먹이는 방법과 신경이없는 히드라를 트랩하는 방법을 설명했지만, 이러한 프로토콜은 적절한 크기로 조심스럽게 잡아 당겨야하는 마이크로 피펫 팁과 튜빙 14로 피펫에 연결된 마우스 피스를 사용해야합니다. 여기에서는 더 간단하고, 안전하며, 시간이 절약되는 사료 공급과 버핑 방법이 설명됩니다.
또한 이전 연구에서는 고정 된 동물을 개별 세포로 분리하고 세포 형태학을 검사하여 신경 세포의 부재를 확인하는 것이 포함되었습니다 3 , 4 , 15 . H예를 들어 알파 – 튜 불린의 티로신 화 된 카르 복실 말단에 대한 단일 클론 항체를 이용한 면역 조직 화학 염색을 hypostome 13 , 16 에서 뉴런의 고갈 여부를 확인하기위한 연쇄 반응의 보완적인 방법으로 사용했다. 이전 연구에서 보듯이 peduncle의 뉴런도이 항체 13을 사용하여 시각화 할 수 있지만,이 뉴런뿐만 아니라 신체 칼럼의 뉴런도 만들어내는 것이 더 어렵습니다. immunohistochemistry hypostome에 신경 세포의 부재를 확인하는 데 충분하고 세포 유형의 형태에 대한 전문 지식을 필요로하지 않지만, 그것은 간질 줄기 세포와 이러한 세포의 다른 파생물의 부재를 확인하는 데 사용할 수 없습니다. 해리 및 세포 형태학 연구는보다 엄격하며 치료의 각 단계 이후에 남아있는 각 세포 유형의 수를 정량적으로 설명 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이드 라 간질 세포는 이중 콜히친 치료를 통해 제거 할 수 있습니다 3 , 4 . 첫 번째 치료를 한 다음날에는 히드라 조각이 변형 된 히드라와 융합되는 것을 피하기 위해 개별 히드라 간의 접촉을 방지하는 것이 중요합니다. 또한, 두 번째 콜히친 치료는 그러한 동물에서 잔여 간질 세포를 제거하기에 충분하지 않을 수 있으므로,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 신경이없는 동물을 생성하고 유지하기위한 원래의 프로토콜에 대해 토론하기 위해 Dr. Dick Campbell (UC Irvine)에게 감사하고, 주사기와 바늘 기술을 적용하는 데 도움을 준 Rui Wang과 Danielle Hagstrom 및 Dr. Rob Steele (UC Irvine)에게 원고에 대한 의견을 말했습니다. 이 연구는 RCSA 및 NSF 보조금 CMMI-1463572에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 ml Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X – 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 ml Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
References
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