Generering og langvarig vedlikehold av nervefri<em> Hydra</em
Summary
Gjennom en dobbel behandling med colchicin, kan et planteavledet toksin som dreper delende celler, genereres nervefri Hydra vulgaris . Disse Hydra kan ikke mate eller egest på egen hånd. Dette dokumentet beskriver en forbedret metode for langvarig vedlikehold av nervefri Hydra vulgaris i laboratoriet.
Abstract
Den interstitiale cellelinjen av Hydra inkluderer multipotente stamceller, og deres derivater: kjertelceller, nematocytter, bakterieceller og nerveceller. Interstitialcellene kan elimineres gjennom to påfølgende behandlinger med kolchicin, et planteavledet toksin som dreper delende celler, og dermed eliminerer potensialet for fornyelse av de differensierte cellene som er avledet fra de interstitielle stamceller. Dette tillater generering av Hydra som mangler nerveceller. En nervefri polyp kan ikke åpne munnen for å mate, egest eller regulere osmotisk trykk. Slike dyr kan imidlertid overleve og bli dyrket på ubestemt tid i laboratoriet dersom de regelmessig blir drevet og burpet. Mangelen på nerveceller gjør det mulig for studier av nervesystemet i regulering av dyrs adferd og regenerering. Tidligere publiserte protokoller for nervefritt Hydra vedlikehold innebærer utdaterte teknikker som munnpipettering med hånddrekket mikropipett tIps å mate og rengjøre Hydra . Her presenteres en forbedret protokoll for vedlikehold av nervefri Hydra . Fine tipped tanger brukes til å tvinge åpne munnen og sette inn nyslått Artemia . Etter kraftmating spyles kroppens hulrom av frisk medium ved hjelp av en sprøyte og en nål for å fjerne ufordelt materiale, her referert til som "burping". Denne nye metoden for kraftmating og burping nervefri Hydra gjennom bruk av tanger og sprøyter eliminerer behovet for munnpipettering ved hjelp av hånddrevne mikropipettips. Det gjør prosessen sikrere og betydelig mer tidseffektiv. For å sikre at nervecellene i hypostomet er eliminert, gjennomføres immunhistokjemi ved bruk av anti-tyrosin-tubulin.
Introduction
Nervesystemet i Hydra består av et nervenett, med nevroner assosiert med begge epitelvevslag 1 . Nervenettet er tettere i hypostom og peduncle og mindre tett i kropps-kolonnen 2 . Nervecellene stammer fra interstitiale stamceller, som er multipotente stamceller som gir opphav til sekretoriske celler, nematocytter, bakterieceller og neuroner 1 . Det er mulig å eliminere interstitialcellene av Hydra vulgaris ved behandling med kolchicin 3 , 4 , et planteavledet toksin som dreper delende celler. Selv om kolchicin har vist seg å hemme mikrotubulærpolymerisasjon i andre organismer, har en tidligere studie vist at mikrotubuli er tilstede i Hydra gjennom hele behandlingen, noe som tyder på at kolchicin ikke virker på denne måten i Hydra 3 . En annen stUty antyder at colchicin ikke binder effektivt til tubulin i noen organismer, inkludert Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas og Schizosaccharomyces pombe, som kan forklare denne forskjellen 5 . Kolchicinbehandlingen inducerer fagocytose av interstitialcellene av endodermale epitelceller 3 og tillater dermed dannelse av dyr som mangler nerveceller, kjertelceller og nematocytter. Det er uklart hvorfor interstitialceller er spesielt utsatt for kolchicinbehandling. Gitt at både postmittotiske interstitiale celler og interstitial stamcellelinje er skadet og fagocytosed, konkluderte Campbell at colchicin ikke direkte påvirker mitotisk aktivitet 3 . Spesielt virker kolchicinbehandlingen godt i Hydra vulgaris, men har vist seg å ikke fungere også i andre arter, for eksempel Hydra oligactis 6 . </Em> En modifisert behandling med colchicin og hydroksyurea kan brukes til å produsere nervefri Hydra viridis 7 . Nervefri Hydra (også noen ganger referert til som "epithelial Hydra " 8 ) er derfor et nyttig verktøy for å studere rollene til disse spesialiserte celletyper fra interstitialcellelinjen i vevshomostase og regenerering.
Hydra kan være det eneste kjente eksemplet på et dyr som er i stand til å leve uten et nervesystem. Nervefri Hydra fungerer som en spesielt nyttig modell for å dissekere nervenettens rolle ved regulering av hydra regenerering, homeostase og oppførsel. For eksempel tillatt introduksjonen av interstitielle celler i nervefri Hydra via podning for karakterisering av nervecelle-differensiering som svært regionsspesifikke 9 . Videre, fordi nervefri Hydra kan regenerere, deAktivere undersøkelsen av alternative, nervesystem-uavhengige regenereringsveier. Et slikt eksempel er apikal neurogenese og hodedannelse , som har vist seg å være avhengig av cnox-2- funksjonen i nervesystemet i wildtype Hydra , men ser ut til å være dispensable i nervefri Hydra , noe som tyder på at det kan være en alternativ hodregenerasjonsprosess 10 .
Nervefri Hydra har også blitt brukt til å studere epitelcelleuttrykk og regulering av neurogene og nevrotransmissionsgener etter tap av neurogenese 11 . Nervefri Hydra utviser ikke spontane sammentrekningsbarder 12 , noe som indikerer at disse utbruddene er regulert av nervesystemet. Nervefri Hydra kontraherer imidlertid som svar på å klemme kropps-kolonnen med tang, noe som tyder på at sammentrekning som følge av mekaniske stimuli blir formidlet ved å koble throuGh-gapskryss i epitelceller, mens spontan kontraktile atferd er formidlet ved å kople mellom gapskryss i nerveceller 13 .
Nervefri Hydra åpner ikke munnen når de presenteres med mat eller redusert glutation 3 , noe som tyder på at sensoriske nevroner er nødvendige for å oppdage nærvær av mat og signal munnen å åpne. I tillegg synes nervenettet å spille en rolle ved å detektere osmotisk trykk, fordi nervfrie dyr ikke er i stand til å regulere sitt interne hydrostatiske trykk gjennom munnåpning, noe som forårsaker deres karakteristiske ballonglignende utseende 3 , 4 ( figur 1B ). Regulering av hydrostatisk trykk i nervefri Hydra ved hyppig manuell deflasjon førte til tap av noen unormal morfologi i hypostom og kroppssøyle. Men kronisk deflasjon førte til forstyrrelse av vekst, elUlation, spirende og vevsorganisasjon 8 .
Selv om nervefri Hydra ikke er i stand til å mate og egest på egenhånd, er det mulig å opprettholde dem på ubestemt tid i laboratoriet ved å manuelt tvinge og dyrke hvert dyr. Tidligere publikasjoner har beskrevet metoder for kraftmating og burping nervefri Hydra , men disse protokollene innebar bruk av mikropipetttips som må håndtras forsiktig til riktig størrelse, samt bruk av et munnstykke som er koblet til pipetten via rør 14 . Her beskrives en enklere, sikrere og mer tidseffektiv metode for fôring og burping.
I tillegg involverte tidligere studier å undersøke fraværet av nerveceller gjennom dissosiasjon av faste dyr i individuelle celler og undersøkelse av cellemorfologi 3 , 4 , 15 . HEre, immunhistokjemi med et monoklonalt antistoff mot tyrosinerte karboksylterminalen av alfa-tubulin ble anvendt som en komprimeringsmetode for macerering for å sjekke uttømmelsen av nevroner i hypostom 13 , 16 . Tidligere studier har vist at nevroner i peduncle kan også visualiseres ved hjelp av dette antistoffet 13 , men disse nevronene, så vel som de i kropps-kolonnen, er vanskeligere å lage. Selv om immunhistokjemi er tilstrekkelig til å bekrefte fraværet av nerveceller i hypostomet og ikke krever ekspertise på celletypemorfologi, kan den ikke brukes til å kontrollere om fraværet av de interstitielle stamceller og de andre derivatene av disse cellene. Dissociation og cellemorfologi studier er strengere og kan gi en kvantitativ oversikt over tallene for hver celletype som gjenstår etter hvert trinn av behandlingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hydra interstitiale celler kan elimineres gjennom en dobbelt kolchicinbehandling 3 , 4 . I dagene etter den første behandlingen er det viktig å forhindre kontakt mellom individuelle Hydra for å unngå fusjon av Hydra- biter i deformert Hydra . Også dyr som kan spise uassistert etter den første behandlingen må fjernes, da den andre kolchicinbehandling ikke kan være tilstrekkelig til å eliminere de gjenværende interstit…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Dr. Dick Campbell (UC Irvine) for diskusjoner om den opprinnelige protokollen for å generere og vedlikeholde nervefrie dyr, fru Rui Wang for hjelp med å tilpasse sprøyten og nålteknikken, og fru Danielle Hagstrom og Dr. Rob Steele (UC Irvine) for kommentarer på manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av RCSA og NSF-bevilgningen CMMI-1463572.
Materials
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 ml Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X – 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 ml Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
References
- Bode, H. R. The interstitial cell lineage of Hydra: a stem cell system that arose early in evolution. J. Cell. Sci. 109, 1155-1164 (1996).
- Hager, G., David, C. N. Pattern of differentiated nerve cells in hydra is determined by precursor migration. Development. 124, 569-576 (1997).
- Campbell, R. D. Elimination of Hydra interstitial and nerve cells by means of colchicine. J. Cell. Sci. 21, 1-13 (1976).
- Marcum, B. A., Campbell, R. D. Development of Hydra lacking nerve and interstitial cells. J. Cell. Sci. 29, 17-33 (1978).
- Burns, R. G. 3H-colchicine binding: Failure to detect any binding to soluble proteins from various lower organisms. Exp. Cell. Res. 81, 285-292 (1973).
- Lee, H. -. T., Campbell, R. D. Development and Behavior of an Intergeneric Chimera of Hydra (Pelmatohydra oligactis Interstitial Cells Hydra attenuata Epithelial Cells). Biol. Bull. 157 (2), 288-296 (1979).
- Novak, P. Preparing Hydra viridis with Nerve Cells and No Interstitial Cells, or with Neither of These Cell Types. Hydra: Research Methods. , 295-297 (1983).
- Wanek, N., Marcum, B. A., Lee, H. -. T., Chow, M., Campbell, R. D. Effect of hydrostatic pressure on morphogenesis in nerve-free Hydra. J. Exp. Zool. 211, 275-280 (1980).
- Minobe, S., Koizumi, O., Sugiyama, T. Nerve cell differentiation in nerve-free tissue of epithelial Hydra from precursor cells introduced by grafting. Dev. Biol. 172 (1), 170-181 (1995).
- Miljkovic-Licina, M., Chera, S., Ghila, L., Galliot, B. Head regeneration in wild-type hydra requires de novo neurogenesis. Development. 134 (6), 1191-1201 (2007).
- Wenger, Y., Buzgariu, W., Galliot, B. Loss of neurogenesis in Hydra leads to compensatory regulation of neurogenic and neurotransmission genes in epithelial cells. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (20150040), (2015).
- Campbell, R. D., Josephson, R. K., Schwab, W. E., Rushforth, N. B. Excitability of nerve-free Hydra. Nature. 262, 388-390 (1976).
- Takaku, Y., Hwang, J. S., et al. Innexin gap junctions in nerve cells coordinate spontaneous contractile behavior in Hydra polyps. Sci. Rep. 4 (3573), (2014).
- Marcum, B. A. Culturing Epithelial Hydra. Hydra: Research Methods. , 287-290 (1983).
- David, C. N. A quantitative method for maceration of Hydra tissue. Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 171, 259-268 (1973).
- Gröger, H., Schmid, V. Larval development in Cnidaria: A connection to Bilateria. Genesis. 29 (3), 110-114 (2001).
- Lenhoff, H. M. Water, Culture Solutions, and Buffers. Hydra: Research Methods. , 29-34 (1983).
- Shenk, M. A., Bode, H. R., Steele, R. E. Expression of Cnox-2, a HOM/HOX homeobox gene in hydra, is correlated with axial pattern formation. Development. 117, 657-667 (1993).
- Böttger, A., et al. Horizontal Gene Transfer Contributed to the Evolution of Extracellular Surface Structures: The Freshwater Polyp Hydra Is Covered by a Complex Fibrous Cuticle Containing Glycosaminoglycans and Proteins of the PPOD and SWT (Sweet Tooth) Families. PLoS One. 7 (12), (2012).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Dev. Biol. 13 (8), (2013).
