Generación y Mantenimiento a Largo Plazo de Nervios<em> Hydra</em
Summary
A través de un doble tratamiento con colchicina, una toxina derivada de plantas que mata a las células en división, Hydra vulgaris libre de nervios puede ser generado. Estos Hydra no puede alimentar o egest en sus los propios. Este artículo describe un método mejorado para el mantenimiento a largo plazo de Hydra vulgaris libre de nervios en el laboratorio.
Abstract
El linaje celular intersticial de Hydra incluye células madre multipotentes, y sus derivados: células de las glándulas, nematocitos, células germinales y células nerviosas. Las células intersticiales se pueden eliminar a través de dos tratamientos consecutivos con colchicina, una toxina derivada de plantas que mata a las células en división, eliminando así el potencial de renovación de las células diferenciadas que se derivan de las células madre intersticiales. Esto permite la generación de Hydra que carecen de células nerviosas. Un pólipo libre de nervios no puede abrir su boca para alimentar, egestar o regular la presión osmótica. Estos animales, sin embargo, pueden sobrevivir y ser cultivados indefinidamente en el laboratorio si se alimentan regularmente con fuerza y eructaron. La falta de células nerviosas permite estudiar el papel del sistema nervioso en la regulación del comportamiento animal y la regeneración. Los protocolos publicados previamente para el mantenimiento de Hydra sin nervios implican técnicas anticuadas, como la pipeta de boca con micropipeta manualIps para alimentar y limpiar la Hydra . Aquí, se introduce un protocolo mejorado para el mantenimiento de la hidra libre de nervios. Pinzas de punta fina se utilizan para forzar la apertura de la boca e insertar recién muertos Artemia . Después de la alimentación forzada, la cavidad corporal del animal se limpia con un medio fresco utilizando una jeringuilla y una aguja hipodérmica para retirar el material no digerido, denominado aquí "eructo". Este nuevo método de alimentación forzada y eructar a la hidra sin nervios mediante el uso de fórceps y jeringas elimina la necesidad de pipetear la boca usando puntas de micropipeta tiradas a mano. Por lo tanto, hace que el proceso más seguro y significativamente más tiempo eficiente. Para asegurar que las células nerviosas en el hypostome han sido eliminadas, inmunohistoquímica utilizando anti-tirosina-tubulina se lleva a cabo.
Introduction
El sistema nervioso de Hydra consiste en una red nerviosa, con neuronas asociadas con ambas capas de tejido epitelial 1 . La red nerviosa es más densa en el hypostome y pedúnculo y menos densa en la columna corporal 2 . Las células nerviosas se originan a partir de células madre intersticiales, que son células madre multipotentes que dan lugar a células secretoras, nematocitos, células germinales y neuronas 1 . Es posible eliminar las células intersticiales de Hydra vulgaris a través del tratamiento con colchicine 3 , 4 , una toxina derivada de plantas que mata a las células en división. Aunque se ha encontrado que la colchicina inhibe la polimerización de microtúbulos en otros organismos, un estudio previo ha demostrado que los microtúbulos están presentes en Hydra durante todo el tratamiento, lo que sugiere que la colchicina no actúa de esta manera en Hydra 3 . OtraUdy sugiere que la colchicina no se une eficazmente a la tubulina en algunos organismos, incluyendo Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas y Schizosaccharomyces pombe, lo que puede explicar esta diferencia 5 . El tratamiento con colchicina induce la fagocitosis de las células intersticiales por las células epiteliales endodérmicas 3 y permite así la creación de animales que carecen de células nerviosas, glándulas y nematocitos. No está claro por qué las células intersticiales son particularmente susceptibles al tratamiento con colchicina. Dado que tanto las células intersticiales post-mitótico y el linaje de las células madre intersticiales están dañados y fagocitados, Campbell llegó a la conclusión de que la colchicina no estaba afectando directamente a la actividad mitótica [ 3] . En particular, el tratamiento con colchicina funciona bien en Hydra vulgaris, pero se ha demostrado que no funciona tan bien en otras especies, como Hydra oligactis 6 . </Em> Un tratamiento modificado con colchicina e hidroxiurea puede ser utilizado para producir Hydra viridis libre de nervios 7 . La Hydra libre de nervios (también denominada a veces " Hydra epitelial" 8 ) es por lo tanto una herramienta útil para estudiar las funciones de estos tipos celulares especializados del linaje celular intersticial en la homeostasis y regeneración de los tejidos.
Hydra puede ser el único ejemplo conocido de un animal capaz de vivir sin un sistema nervioso. La hidra libre de nervios sirve como un modelo particularmente útil para diseccionar el papel de la red nerviosa en la regulación de la regeneración, la homeostasis y el comportamiento de la hidra . Por ejemplo, la introducción de células intersticiales en la hidra libre de nervios a través de injerto permitió la caracterización de la diferenciación de las células nerviosas como altamente específica de la región [ 9] . Además, debido a que la hidra libre de nervios puede regenerarse,Permitir la investigación de alternativas, sistema nervioso independiente de las vías de regeneración. Un ejemplo de ello es la neurogénesis apical y la formación de la cabeza, que se ha demostrado que dependen de la función cnox-2 en el sistema nervioso en el Hydra de tipo silvestre, pero parece ser dispensable en Hydra libre de nervios, sugiriendo que puede haber un proceso alternativo de regeneración de la cabeza 10 .
Hidra libre de nervios también se han utilizado para estudiar la expresión de células epiteliales y la regulación de genes neurogénicos y neurotransmisión después de la pérdida de la neurogénesis [ 11] . La Hidra libre de nervios no exhibe ráfagas de contracción espontánea 12 , lo que indica que estas ráfagas están reguladas por el sistema nervioso. Sin embargo, la hidra libre de nervios se contrae en respuesta a pellizcar la columna del cuerpo con fórceps, lo que sugiere que la contracción en respuesta a estímulos mecánicos está mediada por el acoplamientoGh hueco en las células epiteliales, mientras que el comportamiento contractil espontáneo es mediada por el acoplamiento a través de las uniones gap en las células nerviosas [ 13] .
La Hidra libre de nervios no abre la boca cuando se les presenta con alimentos o glutatión 3 reducido, lo que sugiere que las neuronas sensoriales son necesarias para detectar la presencia de alimentos y señalar la boca para abrir. Además, la red nerviosa parece desempeñar un papel en la detección de la presión osmótica, ya que los animales libres de nervios son incapaces de regular autónomamente su presión hidrostática interna a través de la apertura de la boca, causando su aspecto característico de globo 3 , 4 . La regulación de la presión hidrostática en la hidra libre de nervios mediante una deflación manual frecuente condujo a la pérdida de alguna morfología anormal en el hiposuero y la columna corporal. Sin embargo, la deflación crónica condujo a la interferencia con el crecimiento, elCión, brotación y organización de los tejidos 8 .
Aunque la hidra libre de nervios es incapaz de alimentarse y egestar por sí misma, es posible mantenerlos indefinidamente en el laboratorio mediante la alimentación manual y la eructación de cada animal. Las publicaciones anteriores han descrito métodos de alimentación forzada y eructos de la hidra libre de nervios, sin embargo estos protocolos implicaron el uso de puntas de micropipeta que deben ser tiradas con cuidado al tamaño apropiado así como el uso de una boquilla conectada a la pipeta por el tubo 14 . Aquí, se describe un método más simple, más seguro y más eficiente en tiempo de alimentación y eructos.
Además, los estudios previos implicaron la comprobación de la ausencia de células nerviosas a través de la disociación de animales fijos en células individuales y el examen de la morfología celular [ 3 , 4 , 15] . MARIDOAntes, se utilizó inmunohistoquímica con un anticuerpo monoclonal contra el extremo carboxilo tirosinado de la alfa-tubulina como método complementario de maceración para comprobar el agotamiento de las neuronas en el hipostómetro 13 , 16 . Estudios anteriores han demostrado que las neuronas en el pedúnculo también se pueden visualizar utilizando este anticuerpo 13 , sin embargo estas neuronas, así como los de la columna del cuerpo son más difíciles de hacer. Si bien la inmunohistoquímica es suficiente para confirmar la ausencia de células nerviosas en el hipostómetro y no requiere experiencia en la morfología del tipo celular, no puede utilizarse para comprobar la ausencia de las células madre intersticiales y las otras derivadas de estas células. Los estudios de disociación y morfología celular son más rigurosos y pueden dar una cuenta cuantitativa de los números de cada tipo de células restantes después de cada etapa del tratamiento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las células intersticiales de la hidra pueden eliminarse mediante un tratamiento con doble colchicina 3 , 4 . En los días siguientes al primer tratamiento, es crítico evitar el contacto entre Hydra individual para evitar la fusión de piezas de Hydra en Hydra deformado. Además, los animales que pueden comer sin ayuda después del primer tratamiento deben ser eliminados ya que el segundo tratamiento con colchicina …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al Dr. Dick Campbell (UC Irvine) por las discusiones sobre el protocolo original para la generación y mantenimiento de animales libres de nervios, la Sra. Rui Wang para ayudar con la adaptación de la jeringa y la aguja técnica, y Danielle Hagstrom y Dr. Rob Steele (UC Irvine) para comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el RCSA y la subvención NSF CMMI-1463572.
Materials
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 ml Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X – 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 ml Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
References
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