Sinirsiz Kuşak ve Uzun Süreli Bakım<em> Hydra</em
Summary
Bölücü hücreleri öldüren bitki kaynaklı bir toksin olan kolşisinle çift tedaviyle sinirsiz Hydra vulgaris üretilebilir. Bu Hydra tek başlarına beslenemez veya yemez. Bu yazıda, sinirsiz Hydra vulgaris'in laboratuarda uzun süreli bakım için geliştirilmiş bir yöntem anlatılmaktadır.
Abstract
Hydra'nın interstisyel hücre dizisi multipotent kök hücreler ve bunların türevlerini içerir: bez hücreleri, nematositleri, germ hücreleri ve sinir hücreleri. İnterstisyel hücreler bölme hücrelerini öldüren bitki kökenli bir toksin olan kolşisinle iki ardışık muamele ile ortadan kaldırılabilir, böylece interstisyel kök hücrelerden türetilen farklılaşmış hücrelerin yenilenme potansiyelini ortadan kaldırır. Bu, sinir hücrelerinden yoksun Hydra üretimini sağlar. Bir sinirsiz polip, ozmotik basıncı beslemek, beslemek veya düzenlemek için ağzını açamaz. Ancak bu tür hayvanlar düzenli olarak zorla beslenir ve buruşurlarsa hayatta kalabilir ve süresiz laboratuvarda kültürlenebilir. Sinir hücrelerinin olmaması sinir sisteminin hayvan davranışını ve yenilenmesini düzenleyen rolünü araştırmaya olanak tanır. Sinirsiz Hidra bakımı için önceden yayınlanmış protokoller, elle çekilen mikropipet ile ağız-pipetleme gibi eski tekniklereHydra'yı beslemek ve temizlemek için ips. Burada, sinirsiz Hydra'nın bakımı için geliştirilmiş bir protokol getirildi. İnce uçlu forseps ağzını açmaya zorlamak ve yeni öldürülen Artemia eklemek için kullanılır. Zorla beslemeyi takiben, hayvanın vücut boşluğu burada "burping" olarak anılacak olan, sindirilmemiş malzemenin çıkarılması için bir şırınga ve hipodermik iğne kullanılarak taze ortam ile yıkanır. Forseps ve şırınga yardımıyla sinirsiz Hydra'yı kuvvetle besleyen ve buruşturan bu yeni yöntem, elle çekilen mikropipet uçları kullanarak ağız-pipetleme ihtiyacını ortadan kaldırır. Böylece işlem daha güvenli ve önemli ölçüde zaman kazandırır. Hipostomdaki sinir hücrelerinin ortadan kaldırılmasını sağlamak için, anti-tirosin-tubulin kullanılarak immünohistokimyasal işlem yapılır.
Introduction
Hydra'nın sinir sistemi, her iki epiteliyal doku katmanı 1 ile ilişkili sinir hücrelerinden oluşan bir sinir ağından oluşur. Sinir ağı hipostom ve pedunkülde yoğunlaşır ve vücut kolonu 2'de daha az yoğun olur. Sinir hücreleri, sekresyon hücreleri, nematositleri, germ hücreleri ve nöronları oluşturan multipotent kök hücreler olan interstisyel kök hücrelerden kaynaklanır 1 . Bölücü hücreleri öldüren bitki kaynaklı bir toksin olan kolşisin 3 , 4 ile tedavi ederek Hydra vulgaris'in interstisyel hücrelerini ortadan kaldırmak mümkündür. Kolşisin, diğer organizmalarda mikrotübül polimerizasyonunu inhibe ettiği tespit edilmesine rağmen, bir önceki çalışmada, tüm tedavi boyunca Hydra'da mikrotübüllerin bulunduğunu ve bu da kolchisinin Hydra 3'de bu şekilde davranmadığını ortaya koymuştur. Başka bir stUdy, Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas ve Schizosaccharomyces pombe gibi bazı organizmalarda kolşisin tübüline etkili bir şekilde bağlanmadığını ve bu farkı açıklayabileceğini önermektedir. Kolşisin tedavisi interstisyel hücrelerin endoderm epitel hücreleri 3 tarafından fagositozunu indükler ve böylece sinir hücreleri, bez hücreleri ve nematositlerden yoksun olan hayvanların yaratılmasına izin verir. İnterstisyel hücrelerin neden özellikle kolşisin tedavisine duyarlı olduğu belirsizdir. Hem post-mitotik interstisyel hücreler hem de interstisyel kök hücre dizisi hasar görmüş ve fagositozlanmış olduğu göz önüne alındığında, Campbell, kolşisin mitotik aktiviteyi doğrudan etkilemediği sonucuna varmıştır3. Özellikle, kolşisin tedavisi Hydra vulgaris'de iyi işliyor ancak Hydra oligactis 6 gibi diğer türlerde de çalışmadığı gösterilmiştir . </Em> Sinirsiz Hydra viridis 7'yi üretmek için kolşisin ve hidroksiüre ile değiştirilmiş bir tedavi kullanılabilir. Sinirsiz Hidra (bazen "epitel Hydra " 8 olarak da ifade edilir) doku homeostazı ve rejenerasyonundaki interstisyel hücre soylarından bu özel hücre tiplerinin rollerini incelemek için yararlı bir araçtır.
Hidra , sinir sistemi olmadan yaşayabilen, bilinen tek hayvan örneği olabilir. Sinirsiz Hidra , Hydra rejenerasyonunu, homeostazı ve davranışı düzenleyen sinir ağı rolünü kesmek için özellikle yararlı bir model olarak hizmet eder. Örneğin, interstisyel hücrelerin sinirsiz Hidra'ya greft yoluyla verilmesi, sinir hücrelerinin farklılaşmasının karakterize edilmesi için oldukça bölgeye özel 9 sağlar . Dahası, sinirsiz Hydra yeniden üretebilir, çünküAlternatif, sinir sisteminden bağımsız rejenerasyon yolaklarının araştırılmasını mümkün kılmaktadır. Böyle bir örnek, vahşi tip Hydra'da sinir sisteminde cnox-2 fonksiyonuna bağlı olduğu gösterilmiş olan apikal nevrojenez ve kafa oluşumudur, ancak sinirsiz Hydra'da vazgeçilmez görünmektedir ve alternatif bir kafa rejenerasyon işlemi olabileceğini düşündürmektedir 10 .
Sinirsiz Hidra ayrıca nörojenezin 11 kaybı sonrası epitel hücre ekspresyonunu ve nörojenik ve nörotransmisyon genlerinin düzenlenişini incelemek için kullanılmıştır. Sinirsiz Hidra spontan kontraksiyon patlamaları 12 göstermez, bu patlamaların sinir sistemi tarafından düzenlendiğini gösterir. Bununla birlikte, sinirsiz Hydra vücut sütununu forsepsle tutarak yanıt olarak kontrendikçe, mekanik uyarılara yanıt olarak daralmanın bağlanma yoluyla sağlandığını düşündürmektedirGh boşluk kavşakları, spontan kontraktil davranış ise sinir hücrelerindeki boşluk kavşaklarından geçerek sağlanır 13 .
Sinirsiz Hidra ağızlarını yiyecek veya azalan glutatyon 3 ile birlikte açtığınızda açmaz; bu, duyusal nöronların gıdaların mevcudiyetini tespit etmek ve ağzın açılması için sinyal vermesi gerektiğini gösterir. Buna ek olarak sinir ağı, ozmotik basıncın algılanmasında bir rol oynuyor gibi görünmektedir, çünkü sinirsiz hayvanlar kendi ağızlarındaki açılma yoluyla iç hidrostatik basıncını özerk bir şekilde kontrol edememektedir, bu da karakteristik balon benzeri görünümünü 3 , 4'e çıkarmaktadır ( Şekil 1B ). Sinirsiz Hidraktaki hidrostatik basıncın sık manuel deflasyonla düzenlenmesi hipostome ve vücut kolonunda bazı anormal morfolojilerin kaybına neden olmuştur. Bununla birlikte, kronik deflasyon büyümeye müdahale etmiştir.Tomurcuklanma ve doku organizasyonu 8 .
Her ne kadar sinirsiz Hydra kendi başlarına beslenemez ve üreyemezse de, her hayvanı elle zorla besleyip burping ederek laboratuvarda süresiz olarak korumak mümkündür. Önceki yayınlar, sinirsiz Hydra'nın zorla beslenmesi ve buruşturulması yöntemlerini tarif etmiştir, ancak bu protokoller elle uygun boyuta çekilmesi gereken mikropipet uçlarının yanı sıra pipete 14 boruyla bağlanmış bir ağızlığın kullanılmasıyla ilgilidir. Burada, daha basit, daha güvenli ve daha zamandan tasarruf sağlayan besleme ve burping yöntemi anlatılmıştır.
Buna ek olarak, daha önceki çalışmalar, sabit hayvanların bireysel hücrelere ayrılması ve hücre morfolojisinin incelenmesi yoluyla 3 , 4 , 15 nolu sinir hücrelerinin yokluğunun kontrol edilmesini içermektedir. 'HHipostomda nöronların tükenmesini kontrol etmek için makulasyon için tamamlayıcı bir yöntem olarak alfa-tübülinin tirozin karboksil terminaline karşı bir monoklonal antikor ile immünohistokimya kullanılmıştır 13,16. Önceki çalışmalar, pedanküldeki nöronların da bu antikor 13 kullanılarak görselleştirilebileceğini göstermiştir, ancak bu nöronların yanı sıra vücut kolonundaki nöronların da bulunması daha zordur. İmmünohistokimya hipostomdaki sinir hücrelerinin yokluğunu teyit etmek için yeterlidir ve hücre tipi morfolojide uzmanlık gerektirmezken, interstisyel kök hücrelerin ve bu hücrelerin diğer türevlerinin yokluğunu kontrol etmek için kullanılamaz. Ayrışma ve hücre morfolojisi çalışmaları daha titizdir ve tedavinin her aşamasından sonra kalan her hücre türünün sayısal bir hesabını verebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hydra interstisyel hücreler, çift kolşisin tedavisi 3 , 4 ile ortadan kaldırılabilir. İlk tedaviyi izleyen günlerde, Hydra parçalarının deforme olmuş Hydra'ya kaynaşmasını önlemek için bireysel Hydra arasındaki temastan kaçınmak önemlidir. Ayrıca, ilk tedaviyi takiben yiyebilen hayvanlar kaldırılmalıdır çünkü ikinci kolşisin tedavisi bu tür hayvanlardan kalan interstisyel hücreleri ortadan ka…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, şırınga ve iğne tekniğine uyum konusunda yardım için sinirsiz hayvanlar üretmek ve sürdürmek için orijinal protokol olan Bayan Rui Wang ile Bayan Danielle Hagstrom ve Dr. Rob Steele'in görüşleri için Dr. Dick Campbell'e (UC Irvine) teşekkür ederler. (UC Irvine) el yazması üzerine yorumlar. Bu çalışma RCSA ve NSF hibe CMMI-1463572 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 ml Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X – 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 ml Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
References
- Bode, H. R. The interstitial cell lineage of Hydra: a stem cell system that arose early in evolution. J. Cell. Sci. 109, 1155-1164 (1996).
- Hager, G., David, C. N. Pattern of differentiated nerve cells in hydra is determined by precursor migration. Development. 124, 569-576 (1997).
- Campbell, R. D. Elimination of Hydra interstitial and nerve cells by means of colchicine. J. Cell. Sci. 21, 1-13 (1976).
- Marcum, B. A., Campbell, R. D. Development of Hydra lacking nerve and interstitial cells. J. Cell. Sci. 29, 17-33 (1978).
- Burns, R. G. 3H-colchicine binding: Failure to detect any binding to soluble proteins from various lower organisms. Exp. Cell. Res. 81, 285-292 (1973).
- Lee, H. -. T., Campbell, R. D. Development and Behavior of an Intergeneric Chimera of Hydra (Pelmatohydra oligactis Interstitial Cells Hydra attenuata Epithelial Cells). Biol. Bull. 157 (2), 288-296 (1979).
- Novak, P. Preparing Hydra viridis with Nerve Cells and No Interstitial Cells, or with Neither of These Cell Types. Hydra: Research Methods. , 295-297 (1983).
- Wanek, N., Marcum, B. A., Lee, H. -. T., Chow, M., Campbell, R. D. Effect of hydrostatic pressure on morphogenesis in nerve-free Hydra. J. Exp. Zool. 211, 275-280 (1980).
- Minobe, S., Koizumi, O., Sugiyama, T. Nerve cell differentiation in nerve-free tissue of epithelial Hydra from precursor cells introduced by grafting. Dev. Biol. 172 (1), 170-181 (1995).
- Miljkovic-Licina, M., Chera, S., Ghila, L., Galliot, B. Head regeneration in wild-type hydra requires de novo neurogenesis. Development. 134 (6), 1191-1201 (2007).
- Wenger, Y., Buzgariu, W., Galliot, B. Loss of neurogenesis in Hydra leads to compensatory regulation of neurogenic and neurotransmission genes in epithelial cells. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (20150040), (2015).
- Campbell, R. D., Josephson, R. K., Schwab, W. E., Rushforth, N. B. Excitability of nerve-free Hydra. Nature. 262, 388-390 (1976).
- Takaku, Y., Hwang, J. S., et al. Innexin gap junctions in nerve cells coordinate spontaneous contractile behavior in Hydra polyps. Sci. Rep. 4 (3573), (2014).
- Marcum, B. A. Culturing Epithelial Hydra. Hydra: Research Methods. , 287-290 (1983).
- David, C. N. A quantitative method for maceration of Hydra tissue. Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 171, 259-268 (1973).
- Gröger, H., Schmid, V. Larval development in Cnidaria: A connection to Bilateria. Genesis. 29 (3), 110-114 (2001).
- Lenhoff, H. M. Water, Culture Solutions, and Buffers. Hydra: Research Methods. , 29-34 (1983).
- Shenk, M. A., Bode, H. R., Steele, R. E. Expression of Cnox-2, a HOM/HOX homeobox gene in hydra, is correlated with axial pattern formation. Development. 117, 657-667 (1993).
- Böttger, A., et al. Horizontal Gene Transfer Contributed to the Evolution of Extracellular Surface Structures: The Freshwater Polyp Hydra Is Covered by a Complex Fibrous Cuticle Containing Glycosaminoglycans and Proteins of the PPOD and SWT (Sweet Tooth) Families. PLoS One. 7 (12), (2012).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Dev. Biol. 13 (8), (2013).
