Generering och långvarigt underhåll av nervfria<em> Hydra</em
Summary
Genom en dubbelbehandling med kolchicin kan ett växtbaserat toxin som dödar delningsceller generera nervfri Hydra vulgaris . Dessa Hydra kan inte mata eller äta på egen hand. I detta dokument beskrivs en förbättrad metod för långsiktigt underhåll av nervfria Hydra vulgaris i laboratoriet.
Abstract
Den interstitiella cellstammen av Hydra innefattar multipotenta stamceller och deras derivat: körtelceller, nematocyter, bakterieceller och nervceller. De interstitiella cellerna kan elimineras genom två konsekutiva behandlingar med kolchicin, ett växt-härledt toxin som dödar delningsceller och därmed raderar potentialen för förnyelse av de differentierade celler som härleds från de interstitiella stamcellerna. Detta möjliggör genereringen av Hydra som saknar nervceller. En nervfri polyp kan inte öppna munnen för att mata, egestera eller reglera osmotiskt tryck. Sådana djur kan emellertid överleva och odlas obestämt i laboratoriet om de regelbundet tvingas matas och burpas. Bristen på nervceller möjliggör studier av nervsystemets roll vid reglering av djurbeteende och regenerering. Tidigare publicerade protokoll för nervfri Hydra- underhåll involverar föråldrade tekniker såsom munpipettering med handdriven mikropipett tIps att mata och rengöra Hydra . Här införs ett förbättrat protokoll för underhåll av nervfritt hydra . Finkopplade tångar används för att tvinga öppna munnen och sätta in nydödad Artemia . Efter kraftmatning spolas kroppens kavitet med färskt medium genom att använda en spruta och injektionsnål för att avlägsna osmält material, här refererad till som "burping". Denna nya metod för kraftmatning och burping nervfri Hydra genom användning av tång och sprutor eliminerar behovet av munpipettering med handdriven mikropipettips. Det gör processen så säkrare och betydligt mer tidseffektiv. För att säkerställa att nervcellerna i hypostomen har eliminerats genomförs immunohistokemi med anti-tyrosin-tubulin.
Introduction
Hydra nervsystemet består av ett nervnät med neuroner associerade med båda epitelvävnadsskikten 1 . Narnätet är tätare i hypostomen och pedunellen och mindre tät i kroppsspalten 2 . Nervcellerna härrör från interstitiella stamceller, vilka är multipotenta stamceller som ger upphov till sekretoriska celler, nematocyter, bakterieceller och neuroner 1 . Det är möjligt att eliminera de interstitiella cellerna av Hydra vulgaris genom behandling med colchicin 3 , 4 , ett växt-härledt toxin som dödar delande celler. Fastän kolchicin har visat sig hämma mikrotubulumpolymerisation i andra organismer har en tidigare studie visat att mikrotubuli är närvarande i Hydra under hela behandlingen, vilket tyder på att kolchicin inte verkar på detta sätt i Hydra 3 . En annan stUdy föreslår att colchicin inte binder effektivt till tubulin i vissa organismer, inklusive Tetrahymena pyriformis, Zea mays, Chlamydomonas och Schizosaccharomyces pombe, vilket kan förklara denna skillnad 5 . Kolchicinbehandlingen inducerar fagocytos av interstitiella celler av endodermala epitelcellerna 3 och möjliggör därigenom skapandet av djur som saknar nervceller, körtelceller och nematocyter. Det är oklart varför de interstitiella cellerna är särskilt mottagliga för kolchicinbehandling. Med tanke på att både postmittotiska interstitiella celler och den interstitiella stamcellerna är skadade och fagocytoserade, konstaterade Campbell att colchicin inte direkt påverkar mitotisk aktivitet 3 . Speciellt fungerar kolchicinbehandlingen väl i Hydra vulgaris, men har visat sig inte fungera lika bra för andra arter, såsom Hydra oligactis 6 . </Em> En modifierad behandling med kolchicin och hydroxiurea kan användas för att producera nervfritt Hydra viridis 7 . Nervfri Hydra (även ibland kallad epithelial Hydra 8 ) är därför ett användbart verktyg för att studera rollerna hos dessa specialiserade celltyper från den interstitiella cellstammen i vävnadshomeostas och regenerering.
Hydra kan vara det enda kända exemplet på ett djur som kan leva utan ett nervsystem. Nervfri Hydra fungerar som en särskilt användbar modell för att dissekera nervnätets roll vid reglering av hydra regenerering, homeostas och beteende. Till exempel tillåts införandet av interstitiella celler i nervfri Hydra via ympning för karakterisering av nervcellsdifferentiering som högregionsspecifik 9 . Dessutom, eftersom nervfri Hydra kan regenerera, deMöjliggöra undersökning av alternativa, nervsystemet oberoende regenereringsvägar. Ett sådant exempel är apisk neurogenes och huvudbildning, som har visat sig bero på cnox-2- funktionen i nervsystemet i vildtypshydra, men verkar vara dispenserbar i nervfri Hydra , vilket tyder på att det kan finnas en alternativ huvudregenereringsprocess 10 .
Nervfri hydra har också använts för att studera epitelcelleruttryck och reglering av neurogena och neurotransmissionsgener efter förlusten av neurogenes 11 . Nervfri Hydra uppvisar inte spontana sammandragningsskurar 12 , vilket indikerar att dessa utbrott regleras av nervsystemet. Nervfri Hydra kontraherar emellertid som svar på att klämma i kroppskolonnen med tångar, vilket tyder på att sammandragning som svar på mekaniska stimuli medieras genom koppling throuGh mellanrum i epithelceller, medan spontant kontraktil beteende medieras genom koppling genom gapskikt i nervceller 13 .
Nervfri Hydra öppnar inte sina mun när de presenteras med mat eller reducerad glutation 3 , vilket tyder på att sensoriska neuroner är nödvändiga för att detektera närvaron av mat och signera munnen att öppna. Dessutom verkar nervnätet spela en roll vid avkänning av osmotiskt tryck, eftersom nervfria djur inte kan autonomt reglera sitt interna hydrostatiska tryck genom munöppning, vilket orsakar deras karakteristiska ballongliknande utseende 3 , 4 ( Figur 1B ). Reglering av hydrostatiskt tryck i nervfri Hydra genom frekvent manuell deflation ledde till förlust av någon abnorm morfologi i hypostom och kropps-kolonn. Men kronisk deflation ledde till störning av tillväxten, elOhation, spirande och vävnadsorganisation 8 .
Trots att nervfri Hydra inte kan mata och äta på egen hand, är det möjligt att behålla dem i obestämd tid i laboratoriet genom att manuellt mata och bursta varje djur. Tidigare publikationer har beskrivit metoder för kraftmatande och burpande nervfria Hydra , men dessa protokoll involverade användningen av mikropipettips som måste handdras försiktigt till lämplig storlek samt användning av ett munstycke anslutet till pipetten via rör 14 . Här beskrivs en enklare, säkrare och mer tidseffektiv metod för utfodring och burping.
Vidare involverade tidigare studier att man undersökte frånvaron av nervceller genom dissociering av fasta djur i enskilda celler och undersökning av cellmorfologi 3 , 4 , 15 . HEre, immunohistokemi med en monoklonal antikropp mot den tyrosinerade karboxylterminalen av alfa-tubulin användes som en komprimerad metod för macerering för att kontrollera uttömningen av neuroner i hypostomen 13 , 16 . Tidigare studier har visat att neuroner i peduncle kan också visualiseras med hjälp av denna antikropp 13 , men dessa neuroner samt de som finns i kroppskolonnen är svårare att ta fram. Medan immunhistokemi är tillräcklig för att bekräfta frånvaron av nervceller i hypostomen och inte kräver expertis om celltypmorfologi kan den inte användas för att kontrollera om frånvaron av de interstitiella stamcellerna och de andra derivaten av dessa celler föreligger. Dissociations- och cellmorfologiprover är strängare och kan ge ett kvantitativt redogörande för antalet kvarvarande celltyper efter varje behandlingsstadium.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hydra interstitiella celler kan elimineras genom dubbel kolchicinbehandling 3 , 4 . I dagarna efter den första behandlingen är det avgörande för att förhindra kontakt mellan enskilda Hydra för att undvika fusion av Hydra- delar i deformerade Hydra . Även djur som kan äta oassisterade efter den första behandlingen måste avlägsnas, eftersom den andra kolchicinbehandlingen kanske inte är tillräcklig för att eliminer…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar doktor Dick Campbell (UC Irvine) för diskussioner om det ursprungliga protokollet för att generera och bibehålla nervfria djur, Ms Rui Wang för hjälp med att anpassa sprut- och nåltekniken, och Danielle Hagstrom och Dr. Rob Steele (UC Irvine) för kommentarer till manuskriptet. Detta arbete stöddes av RCSA och NSF-beviljandet CMMI-1463572.
Materials
| Colchicine | Acros Organics | 227120010 | |
| 1 ml Syringe | BD | 301025 | |
| Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | N/A | Can be purchased locally |
| Brine Shrimp Hatchery Dish | Brine Shrimp Direct | N/A | |
| 60 mm x 15 mm Petri Dish | Celltreat | 229663 | |
| 30 G x 3/4" Hypodermic Needle | Covidien | 1188830340 | A 27G needle may also be used |
| 2 x Fine-tip Tweezers | Dumont | 0109-5-PO | |
| Rifampicin | EMD Millipore | 557303 | |
| Goat anti-mouse lgG, Pab (HRP Conjugate) | Enzo | ADI-SAB-100-J | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP9703-100 | |
| Scalpel | Fisher | 08-920A | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10437028 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| PBS Tablets | MP Bio | 2810305 | |
| Monoclonal Anti-Tubulin, Tyrosine | Sigma | T9028 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 216763 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | |
| Triton X – 100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Air Pump | Tetra | 77846-00 | |
| Glass Pasteur Pipette | VWR | 53283-916 | Length of the pipet does not matter |
| 15 ml Tube | VWR | 89039-670 | |
| P320 Sandpaper | 3M | IBGABBV00397 | Can be purchased at local home improvement store |
References
- Bode, H. R. The interstitial cell lineage of Hydra: a stem cell system that arose early in evolution. J. Cell. Sci. 109, 1155-1164 (1996).
- Hager, G., David, C. N. Pattern of differentiated nerve cells in hydra is determined by precursor migration. Development. 124, 569-576 (1997).
- Campbell, R. D. Elimination of Hydra interstitial and nerve cells by means of colchicine. J. Cell. Sci. 21, 1-13 (1976).
- Marcum, B. A., Campbell, R. D. Development of Hydra lacking nerve and interstitial cells. J. Cell. Sci. 29, 17-33 (1978).
- Burns, R. G. 3H-colchicine binding: Failure to detect any binding to soluble proteins from various lower organisms. Exp. Cell. Res. 81, 285-292 (1973).
- Lee, H. -. T., Campbell, R. D. Development and Behavior of an Intergeneric Chimera of Hydra (Pelmatohydra oligactis Interstitial Cells Hydra attenuata Epithelial Cells). Biol. Bull. 157 (2), 288-296 (1979).
- Novak, P. Preparing Hydra viridis with Nerve Cells and No Interstitial Cells, or with Neither of These Cell Types. Hydra: Research Methods. , 295-297 (1983).
- Wanek, N., Marcum, B. A., Lee, H. -. T., Chow, M., Campbell, R. D. Effect of hydrostatic pressure on morphogenesis in nerve-free Hydra. J. Exp. Zool. 211, 275-280 (1980).
- Minobe, S., Koizumi, O., Sugiyama, T. Nerve cell differentiation in nerve-free tissue of epithelial Hydra from precursor cells introduced by grafting. Dev. Biol. 172 (1), 170-181 (1995).
- Miljkovic-Licina, M., Chera, S., Ghila, L., Galliot, B. Head regeneration in wild-type hydra requires de novo neurogenesis. Development. 134 (6), 1191-1201 (2007).
- Wenger, Y., Buzgariu, W., Galliot, B. Loss of neurogenesis in Hydra leads to compensatory regulation of neurogenic and neurotransmission genes in epithelial cells. Phil. Trans. R. Soc. B. 371 (20150040), (2015).
- Campbell, R. D., Josephson, R. K., Schwab, W. E., Rushforth, N. B. Excitability of nerve-free Hydra. Nature. 262, 388-390 (1976).
- Takaku, Y., Hwang, J. S., et al. Innexin gap junctions in nerve cells coordinate spontaneous contractile behavior in Hydra polyps. Sci. Rep. 4 (3573), (2014).
- Marcum, B. A. Culturing Epithelial Hydra. Hydra: Research Methods. , 287-290 (1983).
- David, C. N. A quantitative method for maceration of Hydra tissue. Wilhelm Roux Arch. Entwickl. Mech. Org. 171, 259-268 (1973).
- Gröger, H., Schmid, V. Larval development in Cnidaria: A connection to Bilateria. Genesis. 29 (3), 110-114 (2001).
- Lenhoff, H. M. Water, Culture Solutions, and Buffers. Hydra: Research Methods. , 29-34 (1983).
- Shenk, M. A., Bode, H. R., Steele, R. E. Expression of Cnox-2, a HOM/HOX homeobox gene in hydra, is correlated with axial pattern formation. Development. 117, 657-667 (1993).
- Böttger, A., et al. Horizontal Gene Transfer Contributed to the Evolution of Extracellular Surface Structures: The Freshwater Polyp Hydra Is Covered by a Complex Fibrous Cuticle Containing Glycosaminoglycans and Proteins of the PPOD and SWT (Sweet Tooth) Families. PLoS One. 7 (12), (2012).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Dev. Biol. 13 (8), (2013).
