Anvendelse af en rekombinant Mosquito Densovirus som en Gene levering vektor for den funktionelle analyse af gener i myg larver
Summary
Vi rapport ved hjælp af en kunstig intronic små RNA udtryk strategi til at udvikle en ikke-defekte rekombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) i vivo levering system. En detaljeret procedure for byggeri, emballage og kvantitativ analyse af rAaeDV vektorer så godt som for larver infektion er beskrevet.
Abstract
In vivo mikroinjektion er den mest almindeligt anvendte gen overførsel teknik til at analysere genet funktioner i enkelte myg. Men denne metode kræver en mere teknisk krævende operation og involverer komplicerede procedurer, især når det anvendes i larver på grund af deres lille størrelse, en relativt tynde og skrøbelige neglebånd og høj dødelighed, hvilket begrænser dets anvendelse. Derimod er virale vektorer for gen levering blevet udviklet for at overvinde ekstracellulære og intracellulære barrierer. Disse systemer har fordelene ved let manipulation, høj gen transduktion effektivitet, langsigtede vedligeholdelse af genekspression og evnen til at producere vedvarende virkninger i vivo. Mosquito densoviruses (MDVs) er myg-specifikke, små enkeltstrenget DNA virus, der effektivt kan levere udenlandske nukleinsyrer myg celler; men udskiftning eller indsættelse af fremmede gener oprette rekombinant virus typisk forårsager tab af emballagen og/eller replikering evner, hvilket er en hindring for udviklingen af disse vira som levering vektorer.
Vi rapporterer heri, ved hjælp af en kunstig intronic lille-RNA udtryk strategi til at udvikle en ikke-defekte rekombinant Aedes aegypti densovirus (AaeDV) i vivo levering system. Detaljerede procedurer for byggeri, emballage og kvantitativ analyse af rAaeDV vektorer og for larver infektion er beskrevet.
Denne undersøgelse viser for første gang muligheden for at udvikle en ikke-defekte rekombinant MDV RNA (miRNA) udtryk mikrosystem, og dermed at yde et kraftfuldt værktøj til funktionel analyse af gener i myg og skabe et grundlag for den anvendelse af viral paratransgenesis for kontrollerende myg-bårne sygdomme. Vi viste at Aedes albopictus 1st instar larver kan er være inficeret nemt og effektivt ved at indføre virussen i vand kroppen af larverne avl site og at de udviklede rAaeDVs kunne bruges til overexpress eller vælte den udtryk for et bestemt mål gen i larver, giver et værktøj til funktionel analyse af myg gener.
Introduction
Myg-bårne sygdomme som malaria, dengue feber, zika feber og gul feber, er store internationale folkesundhedsmæssige problemer, som fortsat tegner sig for en betydelig del af global infektionssygdom byrde1,2. Konventionelle insekticider, som har været anvendt som svar på vektorer, er en større komponent af bæredygtig integreret myg kontrolstrategi for forebyggelse af myg-bårne sygdomme. Sådanne strategier har imidlertid vist sig for at være relativt ineffektive eller uønskede på grund af de tilknyttede negative miljøpåvirkninger samt udviklingen af resistens hos mosquito befolkninger3,4. Af disse grunde, der er et presserende behov for alternative metoder til myg kontrol og anvendelse af transgene metoder til at producere sterile mandlige myg og udgivelsen af patogen-resistente myg er opstået som lovende nye kontrolstrategier. For at udvikle effektive nye styre metoder, som sikre og effektive tilgange til i vivo gen levering, den omfattende analyse af myg genfunktion er påkrævet.
Direkte mikroinjektion af plasmid DNA, dobbelt strandede RNA (dsRNA) eller små interfererende RNA (siRNA) er den mest almindeligt anvendte i vivo gen leveringsmetode i myg. I virkeligheden, produktion af transgene stammer af myg stadig stole på en proces af embryo mikroinjektion5,6,7. Mikroinjektion har imidlertid flere begrænsninger. Første, denne teknik er teknisk krævende og involverer komplicerede procedurer. For det andet forårsager injektion en fysiske krænkelse af embryonet, larver, pupper og voksen, som direkte påvirker levedygtigheden af målorganismen. For det tredje er det vanskeligt at immobilisere myg larver for mikroinjektion, fordi de fleste bor i en akvatisk habitat og besidder et karakteristisk vrikkende bevægelse. Fjerde, 1st-2nd instar larver fylder 10 til 20 gange mindre end 4th instar og ældre larver og neglebånd af førstnævnte er mere sart. Disse funktioner gør det vanskeligt at manipulere 1st-2nd instar larver i forhold til dem i ældre faser. Kombineret, bidrager disse faktorer til en reduceret efter injektion overlevelsesraten for larver (ca. 5%) i forhold til voksne8. Viral-baserede levering systemer er blevet udviklet for at overvinde de tilknyttede ekstracellulære og intracellulære barrierer. Disse systemer har fordelene ved let manipulation, høj transduktion effektivitet, langsigtede og robust niveauer af udtryk og evnen til at producere vedvarende virkninger i vivo. Derfor anvendt gen levering systemer udnytter retrovira, lentiviruses og adenovirus har været bredt inmammalian cellelinjer og model arter. Sindbis viral ekspressionssystem havde tidligere været brugt til at analysere funktionen gen i den voksne myg; Udover bekymringer, biosikkerhed, men er injektion stadig en nødvendig proces for virusinfektion9. Selv om den mundtlige levering af iblødsætning larver i dsRNA løsning er blevet rapporteret tidligere som en mulig leveringsmetode, er det uegnede for lille RNA funktion analyse10. Så skal effektiv viral leveringsmetoder stadig udvikles for myg.
Mosquito densoviruses (MDVs) er en del af Densovirinae er den af Parvoviridae, og alle, men en nedgang inden for slægten Brevidensovirus11. MDV virioner er ikke-kappebærende og består af en enkeltstrenget DNA (ssDNA) genom og en ikosaedriske kapsid (20 nm i diameter). Det virale genom er ca 4 kb i størrelse og replikeres i kerner i værtsceller. MDVs er forholdsvis stabilt i miljøet og vise en smal værtsspektrum med høj specificitet for myg. Disse vira har potentiale til at sprede og fortsætter naturligvis i mosquito befolkninger og kan invadere næsten alle organer og væv af disse insekter, herunder midgut, Malpighian tubuli, fedt kroppen, muskulatur, neuroner, og spytkirtler12.
Intakt MDV genomer kan blive subcloned ind i plasmid vektorer til at producere plasmid-baserede smitsomme kloner; Når disse kloner er leveret til myg celler, det virale genom er udvundet fra plasmid vektor og smitsomme viruspartikler er produceret. Fordi MDV har en lille ssDNA genom, smitsomme kloner er let bygget og det virale genom kan være lette at manipulere11,13. Disse egenskaber gør MDV et værdifuldt middel til at undersøge myg biologi. Men, fordi næsten alle af viral genomet sekvens er afgørende for viral spredning, oprettelsen af rekombinant virus ved erstatning eller indsættelse af fremmede gener medfører et tab i viral emballage og/eller replikering evner, som skaber en barriere for udvikling af MDVs som gen levering vektorer. Heri, rapport vi ved hjælp af en kunstig intronic lille-RNA udtryk strategi til at udvikle en ikke-defekte rAaeDV i vivo RNA leveringssystem, der har fordelene ved nem plasmid konstruktion og vedligeholdelse af en funktionel virus, der kan producere stabil og langvarig udtryk i værtsceller uden behov for wild-type virus. Desuden, denne metode giver mulighed for nem transduktion af larver.
Protokollerne for de følgende trin er beskrevet i denne undersøgelse: 1) design af rAaeDVs kodning en intronic lille-RNA udtryk kassette, 2) produktionen af rekombinant viruspartikler ved hjælp af cellen C6/36 emballage linje, 3) kvantitativ analyse af celle-fri rAaeDV genom kopiere numre, og 4) infektion af Ae. albopictus larver af direkte indføring af virus i vand kroppen larve habitat. Alt i alt viste dette arbejde at specifikke små RNA’er eller target gener kan overexpressed eller slået ned i myg larver ved hjælp af den udviklede MDV leveringssystem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er vigtigt at løse to af de vigtigste barrierer, der begrænser rAaeDV konstruktion. Først er produktionen af defekte rekombinant virus. Det er blevet rapporteret, at MDV kan bruges som en vektor til at udtrykke ordentligt størrelse fremmede gener, som scorpion insekt-specifikke neurotoxins20 og normal god landbrugspraksis protein; men uanset konstruktion strategi, når ORFs MDV er indsat eller udskiftet med udefrakommende gener, virioner kan ikke danne uafhængigt medmindre en helper plasmid er cotransfected for …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender finansiel støtte fra den nationale nøgle forskning og udvikling Program i Kina (2016YFC1200500 til Xiao-Guang Chen), National Natural Science Foundation of China (81672054 og 81371846), Team forskningsprogram af naturligt Science Foundation i Guangdong (2014A030312016), og den videnskabelige og teknologiske program over Guangzhou (201508020263). Vi anerkender taknemmeligt Professor Jonathan Carlson (Colorado State University) venligst give pUCA og p7NS1-NGL plasmider og kritisk læsning dette manuskript.
Materials
| Centrifuge machine | Thermo Scientific | 75004260 | |
| Centrifuge System | Beckman Coulter | 363118 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| E.Z.N.A. Plasmid Midi Kit | Omega Biotech | D6904 | |
| Purified Agar | OXOID | LP0028A | |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase (1 U/µL) | Thermo Scientific | EF0651 | |
| FastDigest HpaI | Thermo Scientific | FD1034 | |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | |
| T4 DNA Ligase (5 U/µL) | Thermo Scientific | EL0011 | |
| TransStbl3 Chemically Competent Cell | Beijing Transgen Biotech | CD521-01 | |
| Ampicillin | Beijing Tiangen Biotech | RT501 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco， Life Technologies | 21875109 | |
| Fetal Bovine Serum（ Australia Origin） | Gibco， Life Technologies | 10099141 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco， Life Technologies | 15070063 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen，Life Technologies | 11668019 | |
| Proteinase K | Promega | MC5008 | |
| DNase I (RNase-free) | Invitrogen，Life Technologies | AM2222 | |
| SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) | Beijing Tiangen Biotech | FP205 |
References
- Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current problems in pediatric and adolescent health care. 39, 97-140 (2009).
- Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. The New England journal of medicine. 374, 1552-1563 (2016).
- Roberts, D. R., Andre, R. G. Insecticide resistance issues in vector-borne disease control. The American journal of tropical medicine and hygiene. 50, 21-34 (1994).
- Attaran, A., Roberts, D. R., Curtis, C. F., Kilama, W. L. Balancing risks on the backs of the poor. Nature medicine. 6, 729-731 (2000).
- Volohonsky, G., et al. Transgenic Expression of the Anti-parasitic Factor TEP1 in the Malaria Mosquito Anopheles gambiae. PLoS pathogens. 13, 1006113 (2017).
- Galizi, R., et al. A synthetic sex ratio distortion system for the control of the human malaria mosquito. Nature communications. 5, 3977 (2014).
- Bourtzis, K., Lees, R. S., Hendrichs, J., Vreysen, M. J. More than one rabbit out of the hat: Radiation, transgenic and symbiont-based approaches for sustainable management of mosquito and tsetse fly populations. Acta tropica. 157, 115-130 (2016).
- Kumar, S. S., Puttaraju, H. P. Improvised microinjection technique for mosquito vectors. The Indian journal of medical research. 136, 971-978 (2012).
- Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 13374-13379 (2003).
- Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. Journal of insect science. 13, 69 (2013).
- Ward, T. W., et al. Aedes aegypti transducing densovirus pathogenesis and expression in Aedes aegypti and Anopheles gambiae larvae. Insect molecular biology. 10, 397-405 (2001).
- Carlson, J., Suchman, E., Buchatsky, L. Densoviruses for control and genetic manipulation of mosquitoes. Advances in virus research. 68, 361-392 (2006).
- Barreau, C., Jousset, F. X., Bergoin, M. Pathogenicity of the Aedes albopictus parvovirus (AaPV), a denso-like virus, for Aedes aegypti mosquitoes. Journal of invertebrate pathology. 68, 299-309 (1996).
- Liu, P., et al. Development of non-defective recombinant densovirus vectors for microRNA delivery in the invasive vector mosquito, Aedes albopictus. Scientific reports. 6, 20979 (2016).
- Ortega, M. M., Bouamar, H. Guidelines on Designing MicroRNA Sponges: From Construction to Stable Cell Line. Methods in molecular biology. 1509, 221-233 (2017).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of visualized experiments : JoVE. , e253 (2007).
- Afanasiev, B. N., Kozlov, Y. V., Carlson, J. O., Beaty, B. J. Densovirus of Aedes aegypti as an expression vector in mosquito cells. Experimental parasitology. 79, 322-339 (1994).
- Hu, H. Y., et al. Evolution of the human-specific microRNA miR-941. Nature communications. 3, 1145 (2012).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74, 5463-5467 (1977).
- Dalby, B., et al. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications. Methods (San Diego, Calif). 33, 95-103 (2004).
- Gu, J. B., Dong, Y. Q., Peng, H. J., Chen, X. G. A recombinant AeDNA containing the insect-specific toxin, BmK IT1, displayed an increasing pathogenicity on Aedes albopictus. The American journal of tropical medicine and hygiene. 83, 614-623 (2010).
- Hou, Y., Zhang, H., Miranda, L., Lin, S. Serious overestimation in quantitative PCR by circular (supercoiled) plasmid standard: microalgal pcna as the model gene. PloS one. 5, 9545 (2010).
- Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2016).
