Anvendelse af kapsler til negativ farvning af virale prøver inden for biokonduktion

Summary

Denne protokol giver vejledning til negative farvningsvirusprøver, der let kan bruges i BSL-2, -3 eller -4-laboratorier. Det omfatter brugen af ​​en innovativ behandlingskapsel, som beskytter transmissionselektronmikroskopi nettet og giver brugeren nemmere håndtering i de mere turbulente miljøer inden for biokonduktion.

Abstract

Transmissionselektronmikroskopi (TEM) bruges til at observere ultrastrukturen af ​​vira og andre mikrobielle patogener med nanometeropløsning. De fleste biologiske materialer indeholder ikke tætte elementer, der er i stand til at sprede elektroner for at skabe et billede; Derfor kræves en negativ plet, som placerer tætte tungmetalsalte rundt om prøven. For at visualisere virus i suspension under TEM skal de påføres små rister, der er belagt med en gennemsigtig overflade, kun nanometer tyk. På grund af deres lille størrelse og skrøbelighed er disse grids vanskelige at håndtere og let flyttes af luftstrømme. Den tynde overflade er let beskadiget, hvilket giver prøven svært eller umuligt billede. Infektiøse vira skal håndteres i et biosikkerhedsskabe (BSC), og nogle kræver et biokonduktiv laboratoriemiljø. Farvevirus i biosikkerhedsniveauer (BSL) -3 og -4 er særligt udfordrende, fordi disse miljøer er mere turbulente og teknikere er påkrævet tO Brug personlige værnemidler (PPE), hvilket reducerer fingerfrekvensen.

I denne undersøgelse vurderede vi en ny enhed til at hjælpe med negative farvningsvirus i biokontainering. Enheden er en kapsel, der fungerer som en special pipettespids. Når rister er fyldt ind i kapslen, aspirerer brugeren simpelthen reagenser ind i kapslen for at aflevere virussen og pletterne til det indkapslede gitter, hvilket eliminerer brugerhåndtering af gitter. Selvom denne teknik er designet specielt til brug i BSL-3 eller -4-biokonduktion, kan det lette prøveforberedelsen i ethvert laboratoriemiljø ved at muliggøre let negativ farvning af virus. Denne samme metode kan også anvendes til fremstilling af negative farvede TEM-prøver af nanopartikler, makromolekyler og lignende prøver.

Introduction

Transmissionselektronmikroskopi (TEM) er et effektivt redskab til at se morfologi og ultrastruktur af biologiske prøver, der er for små, til at ses med et traditionelt lysmikroskop ^{1 , 2 , 3 , 4} . TEM'er skyder elektroner gennem en meget tynd prøve, der producerer et højere opløsningsbillede, da elektroner har en meget kortere bølgelængde end lys. Regioner af prøven, der bøjer eller blokkerer elektroner, ser mørke ud, mens områder, der er elektronlucent, fremstår som hvide.

Mangel på elektron tæt stof gør viruser vanskelige at se under en TEM, fordi de ikke kan scatter elektroner. Negativ farvning er den mest almindelige metode til at oprette kontrast og se virus med en TEM. Den første negative farvningsprocedure blev foreslået af Brenner og Horne i 1959, baseret på et eksperiment hvor Hall (1955) og Huxley (1957) observeredeVed udseendet af biologiske strukturer i omvendt kontrast, når de nedsænkes i et elektron-tæt stof ⁵ . Processen med negativ farvning har været stort set uændret i løbet af det sidste halve århundrede. Negativ farvning indebærer kort anvendelse af en tungmetalsaltopløsning på en prøve på et TEM-net i et forsøg på at omslutte virussen med tæt materiale uden at infiltrere viruset ⁶ . Dette skaber en mørk kant og afslører partikelens form ⁵ . Denne undersøgelse bruger to reagenser til negativ farvning, uranylacetat (UA) og kaliumphosphotungstic acid (PTA). Begge disse pletter anvendes almindeligt til at plette små biologiske prøver negativt, såsom vira, proteinkomplekser og nanopartikler ^{7 , 8 , 9} .

Den konventionelle negative farvningsteknik er den manuelle dråbe negative farvningsteknologiNique ⁷ . Denne metode kræver præcis håndtering af små, skrøbelige TEM grids med tang for at anvende små mængder af virusprøve, plet og skylninger. Den typiske fremstillingsprotokol involverer påføring af en dråbe prøveekspension på overfladen af ​​et filmcoatet TEM-gitter ( figur 1A ). Efter tilslutning af prøven til filmoverfladen skylles gitteret for at fjerne ikke-vedhængende vira og farves med enten UA eller PTA i nogle sekunder til et minut afhængigt af typen af ​​prøve. Overskydende væske er ond væk fra gitteret ved at røre et stykke filterpapir til kanten af ​​gitteret.

Den manuelle dråbe metode kræver, at hvert gitter skal fremstilles individuelt. Hvis de ikke håndteres omhyggeligt, kan de coatede TEM-net nemt punkteres, bøjes eller forurenes. Behandling af flere prøver kan medføre problemer med at spore nettet og sikre ensartet farvning for hver prøve. Denne manuelle farvningsprocedure er meget mere dEffektive, når det udføres på biosikkerhedsniveau (BSL) -3 og -4 biokonduktionslaboratorier, på grund af det krævede personlige værnemiddel (PPE), der kræves for disse miljøer. PPE er besværligt, og biokonduktionsmiljøet er meget mere turbulent sammenlignet med et almindeligt laboratorium. Personale i BSL-3 biokonduktionslaboratorier skal have 2 par handsker og arbejde i et biosikkerhedsskabe (BSC). Dette dobbeltlag af handsker reducerer taktil følsomhed og begrænser finmotor bevægelse. Luftstrømmen af ​​BSC, der beskytter brugeren og hjælper med at forhindre prøveforurening kan medføre, at prøverne og pletterne tørrer for hurtigt og dermed påvirker pletkvaliteten. Den stærke turbulente luftstrøm i BSC kan også hurtigt blæse væk et gitter, der ikke er godt sikret. I BSL-4 biokonduktionslaboratorier er der yderligere sikkerhedskrav. Personale skal have en positiv trykdragt, som yderligere begrænser fysisk bevægelse og evnen til at se og manipulere klartUlate grids. Teknikeren, der arbejder i BSL-4, bærer også mindst 2 par handsker, hvor det ydre par er en tyk handske, der i høj grad reducerer fingerfærdighed og taktil følelse. Endelig er de tang, der bruges til at håndtere TEM-gitter, skarpe og derved udgør en risiko for teknikeren på grund af deres evne til at punktere handsker. Med kapsler, der indeholder gitter, er tænger ikke nødvendige, hvilket giver et sikkert, tangfrit alternativ til manipulation af gitter i biokontainering. Endelig tilvejebringer kapslerne også en effektiv måde at lagre gitter under behandling, osmiumdampdekontaminering og under opbevaring; Hvorved netene organiseres og sikres mod skader.

I denne rapport introducerer vi en ny metode til negativ farvning af TEM-net i biokonduktionslaboratorier, der anvender mPrep / g kapsler, en kapselbaseret enhed til nethåndtering og farvning ^{10 , 11 , 12} . Kapslen accomModificerer to TEM-net, minimerer direkte håndtering og reducerer potentialet for netskader. Kapslen føjes direkte til en enkelt- eller flerkanalspipette på samme måde som en pipettespids, hvilket tillader anvendelse af forskellige væsker til gitter indeholdt i. Dette muliggør samtidig forberedelse af flere prøver med dubletter ( figur 1B ). Til negativ plet med kapsler aspireres virusprøven ind i kapslen og holdes i 10 minutter for at lade virusserne adsorbere på gitterfladerne. Gitterene med adsorberet virus vaskes efterfølgende med deioniseret (dI) vand og farves med enten UA eller PTA i nogle få sekunder til 1 min. Denne proces bruger de samme protokolstrin og reagenser som den manuelle dråbe metode; Forskellen er, at alt arbejde sker inden i kapslen uden fysisk håndtering af gitterene. ( Fig. 1C , 1D ).

Formålet med denne undersøgelse var at evaluere kapsler somEn ny metode til negativ farvning af virusprøver i biokonduktionsmiljøer. Denne undersøgelse undersøgte også kvaliteten af ​​TEM-billeder fremstillet ved to forskellige virusinaktiveringsprocedurer: 1) hurtig inaktivering med 1% osmiumtetroxiddamp og 2) 24 timers inaktivering med 2% glutaraldehyd. Begge disse blev udført under anvendelse af kapslerne. Endelig vurderede vi to almindeligt anvendte negative pletter, UA og PTA, til brug i kapslen. ¹³

Protocol

1. Eksperimentforberedelse i et BSL-2 miljø før arbejde med virusprøverne Forbered eller køb Formvar og carbonbelagt TEM kobbergitter, normalt 200-400 mesh. Indsæt de coatede TEM-gitter i kapsler. Brug en forstørret linse til at gøre denne proces nem at udføre. Et eller to gitter kan indsættes i hver kapsel. Forlæste kapsler kan købes for at eliminere dette trin, hvis det ønskes. Overfør kapslerne med indsatte TEM coatede net sammen med andr…

Representative Results

Kapselmetoden producerer god kvalitet negativ farvning til TEM-billeddannelse: For det første vurderede vi kvaliteten af ​​billeder genereret ved at bruge både manuel dråbe metode og kapsel metoder til negativ farvning Zaire ebolavirus. Ebolaviruser er medlemmer af Filoviridae- familien sammen med Marburg-virus. Ebolavirus er typisk 80 til 100 nm i diameter og kan være over 1000 nm i længden. Ebolavirus skal hå…

Discussion

Negativ farvning er en værdifuld TEM-teknik til evaluering og størrelsen af ​​virus, proteinkomplekser og nanopartikler. Droplet forberedelse af disse prøver ved manuel flytning af gitter fra reagens til negative pletter har været den klassiske protokol i mere end et halvt århundrede. Det er en simpel proces, men kræver ekspertise opnået gennem træning for vellykket gennemførelse. Fremragende negativ farvning betragtes stadig som et avanceret færdighedssæt og meget ønskeligt i mange TEM-laboratorier. Kap…

Materials

Formvar/carbon coated TEM grids	SPI	3420C-MB	200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g capsules	EMS	85010-01	box
mPrep/g couplers	EMS	85010-11	standard 16/Pk
glutaraldehdyde	EMS	16320	50% solution, EM grade
Osmium Tetroxide	EMS	19190	4% aqueous solution
Uranyl Acetate	EMS	22400	powder
Potassium phosphotungstic acid	EMS	19500	powder
filter paper	Whatman	1450-090	size 50
Tranmission Electron Microscope	JEOL	JEM-1011	TEM