Utilisation de capsules pour la coloration négative des échantillons viraux dans le cadre du suivi biologique
Summary
Ce protocole fournit des instructions pour les échantillons de virus à coloration négative qui peuvent être facilement utilisés dans les laboratoires BSL-2, -3 ou -4. Il comprend l'utilisation d'une capsule de traitement innovante, qui protège la grille de microscopie électronique de transmission et fournit à l'utilisateur une manipulation plus facile dans les environnements les plus turbulents au sein du biocontainment.
Abstract
La microscopie électronique par transmission (TEM) est utilisée pour observer l'ultrastructure des virus et d'autres agents pathogènes microbiens avec une résolution nanométrique. La plupart des matériaux biologiques ne contiennent pas d'éléments denses capables de diffuser des électrons pour créer une image; Par conséquent, une tache négative, qui place des sels de métaux lourds denses autour de l'échantillon, est nécessaire. Afin de visualiser les virus en suspension sous TEM, ils doivent être appliqués sur de petites grilles revêtues d'une surface transparente de seulement des nanomètres d'épaisseur. En raison de leur faible taille et de leur fragilité, ces réseaux sont difficiles à manipuler et facilement déplacés par les courants d'air. La surface mince est facilement endommagée, laissant l'échantillon difficile ou impossible à l'image. Les virus infectieux doivent être manipulés dans un cabinet de prévention des risques biotechnologiques (BSC) et certains nécessitent un environnement de laboratoire de biocontainment. La coloration des virus dans les niveaux de biosécurité (BSL) -3 et -4 est particulièrement difficile car ces environnements sont plus turbulents et des techniciens sont nécessaires tO porter un équipement de protection individuelle (EPI), ce qui diminue la dextérité.
Dans cette étude, nous avons évalué un nouveau dispositif pour aider à la coloration négative des virus dans le biocontainment. L'appareil est une capsule qui fonctionne comme une pointe de pipette spécialisée. Une fois que les grilles sont chargées dans la capsule, l'utilisateur élimine simplement les réactifs dans la capsule pour délivrer le virus et les taches à la grille encapsulée, éliminant ainsi la manipulation par l'utilisateur des grilles. Bien que cette technique ait été conçue spécifiquement pour une utilisation dans BSL-3 ou -4 biocontainment, elle peut faciliter la préparation des échantillons dans n'importe quel environnement de laboratoire en permettant une coloration négative facile du virus. Cette même méthode peut également être appliquée pour préparer des échantillons TEM colorés négatifs de nanoparticules, de macromolécules et de spécimens semblables.
Introduction
La microscopie électronique à transmission (TEM) est un outil efficace pour visualiser la morphologie et l'ultrastructure des spécimens biologiques trop petits pour être vus avec un microscope optique traditionnel 1 , 2 , 3 , 4 . Les TEM tirent des électrons à travers un spécimen très mince produisant une image à résolution plus élevée puisque les électrons ont une longueur d'onde beaucoup plus courte que la lumière. Les régions de l'échantillon qui se plient ou bloquent des électrons apparaissent sombres, alors que les régions électronucléaires apparaissent blanches.
Le manque de matière électronique dense rend les virus difficiles à voir sous un TEM car ils ne peuvent pas disperser les électrons. La coloration négative est la méthode la plus commune utilisée pour créer un contraste et afficher des virus avec TEM. La première procédure de coloration négative a été proposée par Brenner et Horne en 1959, sur la base d'une expérience où Hall (1955) et Huxley (1957) ont observéL'apparition de structures biologiques en contraste inverse lorsqu'elles sont immergées dans une substance densément électronique 5 . Le processus de coloration négative n'a pratiquement pas changé au cours du dernier demi-siècle. La coloration négative consiste à appliquer brièvement une solution de sel de métaux lourds à un échantillon sur une grille TEM afin d'entourer le virus avec un matériau dense sans infiltrer le virus 6 . Cela crée une bordure sombre et révèle la forme de la particule 5 . Cette étude utilise deux réactifs pour la coloration négative, l'acétate d'uranyle (UA) et l'acide phosphotungstique de potassium (PTA). Ces deux taches sont couramment utilisées pour tacher les petits échantillons biologiques, tels que les virus, les complexes protéiques et les nanoparticules 7 , 8 , 9 .
La technique de coloration négative classique est la technologie manuelle de coloration négative des gouttelettesNique 7 . Cette méthode nécessite une manipulation précise des grilles TEM petites et fragiles avec des pinces pour appliquer de petites quantités d'échantillons de virus, de taches et de rinçages. Le protocole de préparation typique implique l'application d'une gouttelette de suspension d'échantillon sur la surface d'une grille TEM revêtue de film ( figure 1A ). Après la fixation de l'échantillon sur la surface du film, la grille est rincée pour éliminer les virus non adhérents et colorée avec UA ou PTA pendant quelques secondes à une minute, selon le type d'échantillon. L'excès de liquide est méchant de la grille en touchant un morceau de papier filtre au bord de la grille.
La méthode manuelle de gouttelette exige que chaque grille soit faite individuellement. Si elles ne sont pas manipulées avec précaution, les grilles TEM revêtues sont facilement perforées, courbées ou contaminées. Le traitement de multiples échantillons peut entraîner des difficultés dans le suivi des grilles et une coloration uniforme pour chaque échantillon. Cette procédure de coloration manuelle est beaucoup plus dSi difficile lorsqu'ils sont effectués dans des laboratoires de biocotour (BSL) -3 et -4 biocontainment, en raison de l'équipement de protection individuelle nécessaire (EPI) requis pour ces environnements. L'EPI est lourd et l'environnement biocontainment est beaucoup plus turbulent par rapport à un laboratoire régulier. Le personnel travaillant dans les laboratoires de bioconfinement BSL-3 doit porter 2 paires de gants et travailler dans un cabinet de biosécurité (BSC). Cette double couche de gants réduit la sensibilité tactile et limite le mouvement du moteur. Le flux d'air du BSC qui protège l'utilisateur et contribue à prévenir la contamination de l'échantillon peut provoquer une séchage trop rapide des échantillons et des taches, ce qui affecte la qualité de la tache. Le fort flux d'air turbulent dans le BSC peut également épuiser rapidement une grille qui n'est pas bien sécurisée. Dans les laboratoires de biocontainment BSL-4, il existe des exigences de sécurité supplémentaires. Le personnel doit porter une combinaison de pression positive, ce qui limite davantage le mouvement physique et la capacité de visualiser et de manipuler clairementGrilles ulateuses. Le technicien travaillant dans BSL-4 porte également au moins 2 paires de gants, la paire extérieure étant un gant épais qui réduit considérablement la dextérité et la sensation tactile. Enfin, les pinces utilisées pour traiter les grilles TEM sont nettes, ce qui pose un risque pour le technicien en raison de leur capacité à perforer les gants. Avec des capsules contenant des grilles, les pinces ne sont pas nécessaires, fournissant ainsi une alternative sans danger pour la manipulation des grilles dans le biocontainment. Enfin, les capsules fournissent également un moyen efficace de stocker les grilles pendant le traitement, la décontamination de la vapeur d'osmium et pendant le stockage; Ce qui permet de garder les grilles organisées et à l'abri des dégâts.
Dans ce rapport, nous introduisons une nouvelle méthode pour les grilles TEM de coloration négative dans les laboratoires de biocontainment qui utilisent des capsules mPrep / g, un dispositif à base de capsules pour la manipulation du réseau et la coloration 10 , 11 , 12 . La capsule accomMode deux grilles de TEM, minimise la manipulation directe et réduit le risque de dégâts du réseau. La capsule s'attache directement à une pipette à une ou plusieurs canaux de la même manière qu'une pointe de pipette, ce qui permet l'application de divers liquides dans des grilles contenues à l'intérieur. Ceci permet la préparation simultanée d'échantillons multiples avec des réseaux en double ( figure 1B ). Pour une coloration négative avec des capsules, l'échantillon de virus est aspiré dans la capsule et maintenu pendant 10 minutes pour permettre aux virus d'adsorber sur les surfaces de la grille. Les grilles avec le virus adsorbé sont ensuite lavées avec de l'eau désionisée (DI) et colorées avec UA ou PTA pendant quelques secondes à 1 min. Ce processus utilise les mêmes étapes de protocole et réactifs que la méthode de gouttelettes manuelle; La différence étant que tous les travaux se produisent à l'intérieur de la capsule sans manipulation physique des grilles. ( Figures 1C , 1D ).
Le but de cette étude était d'évaluer les capsules commeUne nouvelle méthode pour la coloration négative des échantillons de virus dans les environnements de biocontainment. Cette étude a également examiné la qualité des images TEM produites à partir de deux procédures d'inactivation de virus différentes: 1) inactivation rapide, avec 1% de vapeur de tétroxyde d'osmium, et 2) une inactivation de 24 h avec 2% de glutaraldéhyde. Les deux ont été conduits en utilisant les capsules. Enfin, nous avons évalué deux taches négatives couramment utilisées, UA et PTA, pour une utilisation dans la capsule. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
La coloration négative est une technique TEM précieuse pour évaluer et dimensionner les virus, les complexes protéiques et les nanoparticules. La préparation des gouttelettes de ces éprouvettes par déplacement manuel des grilles du réactif aux taches négatives a été le protocole classique depuis plus d'un demi-siècle. C'est un processus simple, mais nécessite une expertise acquise grâce à la formation pour réussir. Une excellente coloration négative est toujours considérée comme un ensemble de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le Dr John Carra et Rowena Schokman pour la fourniture de Nano-VLP Ebola purifiés, le Dr Rajini Mudhasani pour la fourniture du virus Chikungunya et le Dr Charles (Jason) Shoemaker pour la fourniture de VLP à la leucémie murine exprimant les glycoprotéines d'Ebolavirus. Nous tenons également à remercier MAJ Carl Soffler pour avoir facilité le programme de stages d'été (SIP) et le Programme d'apprentissage en sciences et en génie (SEAP) et la Dre Catherine Wilhelmsen pour la formation en sécurité de laboratoire.
Materials
| Formvar/carbon coated TEM grids | SPI | 3420C-MB | 200 mesh Cu Pk/100 |
| mPrep/g capsules | EMS | 85010-01 | box |
| mPrep/g couplers | EMS | 85010-11 | standard 16/Pk |
| glutaraldehdyde | EMS | 16320 | 50% solution, EM grade |
| Osmium Tetroxide | EMS | 19190 | 4% aqueous solution |
| Uranyl Acetate | EMS | 22400 | powder |
| Potassium phosphotungstic acid | EMS | 19500 | powder |
| filter paper | Whatman | 1450-090 | size 50 |
| Tranmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1011 | TEM |
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