Biocontainmentにおけるウイルスサンプルの陰性染色のためのカプセルの利用
Summary
このプロトコルは、BSL-2、-3、または-4の実験室で容易に使用することができる陰性染色ウイルスサンプルのための指示を提供する。これには透過電子顕微鏡グリッドを保護する革新的な処理カプセルの使用が含まれ、生化学の中でより乱暴な環境での取り扱いが容易になります。
Abstract
透過電子顕微鏡（TEM）は、ナノメートルの分解能を有するウイルスおよび他の微生物病原体の超微細構造を観察するために使用される。ほとんどの生物材料は、電子を散乱して画像を生成することができる緻密な要素を含まない。したがって、試料の周りに濃密な重金属塩を配置するネガティブな染色が必要である。 TEM下で懸濁液中のウイルスを可視化するためには、ナノメートルの厚さの透明な表面で被覆された小さなグリッドに適用する必要があります。サイズが小さく、脆弱であるため、これらのグリッドは取り扱いが難しく、気流によって容易に移動することができます。薄い表面は容易に損傷し、試料を画像化することを困難または不可能にする。感染性ウイルスは、バイオセーフティキャビネット（BSC）で取り扱われなければならず、またあるものは生物接種実験環境が必要です。ウイルスのバイオセーフティーレベル（BSL）-3および-4での染色は、これらの環境がより乱暴であり、技術者が必要とされるため特に困難ですo身体障害を減少させる個人用保護具（PPE）を着用する。
この研究では、生体適合性の陰性染色ウイルスを支援する新しいデバイスを評価しました。このデバイスは、特殊なピペットチップとして機能するカプセルです。グリッドがカプセル内に装填されると、ユーザーはカプセルに試薬を吸引してカプセル化されたグリッドにウイルスおよびステインを送達し、グリッドのユーザー操作を排除する。この技術はBSL-3または-4の生体適合性のために特別に設計されていますが、ウイルスのネガティブ染色を容易にすることにより、あらゆる実験環境でサンプル調製を容易にすることができます。この同じ方法を、ナノ粒子、高分子および類似の試料のネガティブ染色TEM試料を調製するために適用することもできる。
Introduction
透過型電子顕微鏡（TEM）は、従来の光学顕微鏡1、2、3、4で見られるには小さすぎる生物学的試料の形態および超微細構造を表示するための有効なツールです。 TEMは、電子が光よりもはるかに短い波長を有するので、より高い解像度の画像を生成する非常に薄い標本を通して電子を撃つ。電子を曲げたりブロックするサンプルの領域は暗く見え、電子ルーセントの領域は白く見えます。
電子密度の問題の欠如は、電子を散乱させることができないため、ウイルスをTEM下で見ることを困難にする。ネガティブ染色は、コントラストを作成し、TEMでウイルスを観察するために使用される最も一般的な方法です。 Hall（1955）とHuxley（1957）が観察した実験に基づいて、最初のネガティブ染色手順がBrenner and Horneによって1959年に提案された電子密度の高い物質に浸したとき、逆のコントラストの生物学的構造の出現5 。陰性染色のプロセスは、過去半世紀にわたって事実上変わらなかった。ネガティブ染色は簡単にウイルス6を浸透させずに密な材料でウイルスを囲むための試みにTEMグリッド上のサンプルへの重金属塩溶液を適用することを含みます。これは、暗い境界線を作成し、粒子の形状5を明らかにする。この研究では、ネガティブ染色のために酢酸ウラニル（UA）とリンタングステン酸カリウム（PTA）の2種類の試薬を使用しています。これらの汚れの両方は、一般に負、ウイルス、タンパク質複合体、およびナノ粒子7、 図8、 図9のような小さな生物学的サンプルを染色するために使用されます。
従来のネガティブ染色法は、手動の液滴ネガティブ染色技術であるニーク7 。この方法は、少量のウイルスサンプル、ステイン、およびリンスを適用するために、鉗子を用いて、壊れやすい小さなTEMグリッドを正確に取り扱う必要があります。典型的な調製プロトコルは、フィルムコーティングされたTEMグリッドの表面上に試料懸濁液の液滴を適用することを含む（ 図1A ）。サンプルをフィルム表面に付着させた後、グリッドを洗浄して非付着性ウィルスを除去し、サンプルのタイプに応じてUAまたはPTAで数秒〜1分間染色する。余分な液体はグリッドの縁に濾紙の片を触れることによってグリッドから逃げる。
手動液滴法では、各グリッドを個別に作成する必要があります。注意深く取り扱わなければ、コーティングされたTEMグリッドは容易に穿孔され、曲がり、または汚染される。複数のサンプルを処理すると、グリッドを追跡することが困難になり、各サンプルの染色が一貫して行われます。このマニュアル染色手順は、より多くのdこれらの環境に必要な個人用保護具（PPE）が必要であるため、バイオセーフティレベル（BSL）-3および-4バイオ実験ラボで実施された場合は不可能です。 PPEは煩雑で、生物学的環境は通常の研究室に比べてはるかに乱暴です。 BSL-3バイオ実験ラボで働く人材は、2組の手袋を着用し、バイオセーフティキャビネット（BSC）で作業する必要があります。この手袋の二重層は、触覚感度を低下させ、細かい運動を制限します。ユーザーを保護し、サンプルの汚染を防止するのに役立つBSCの気流は、サンプルおよび染みをあまりにも速く乾燥させ、汚染の質に影響を与える可能性があります。 BSCの強い乱流気流は、十分に保護されていないグリッドをすばやく吹き飛ばすこともできます。 BSL-4生物養成研究所では、追加の安全要件があります。要員は、身体的な動きとはっきりと見ることと操作する能力をさらに制限する正の圧力スーツを着用する必要がありますグリッドを灰化する。 BSL-4で働く技術者も少なくとも2対の手袋を着用し、外側のペアは手袋の手触りが良く、器用さと触感が大幅に低下します。最後に、TEMグリッドを取り扱うために使用される鉗子は鋭利であり、それにより手袋を穿刺する能力のために技術者に危険をもたらす。グリッドを含むカプセルでは、鉗子は必要ではないため、生体適合性のグリッドを操作するための安全で鉗子がない代替物を提供する。最後に、カプセルはまた、処理中、オスミウム蒸気汚染除去中、および貯蔵中にグリッドを貯蔵する効果的な方法を提供する。グリッドを組織化し、損傷から安全に保ちます。
本稿では、mPrep / gのカプセル、グリッド処理と10、11、12を染色するためのカプセルベースのデバイスを利用する生物学的封じ込め実験室におけるネガティブ染色TEMグリッドのための新しい方法を導入します。カプセル収容部2つのTEMグリッドを修正し、直接の取り扱いを最小限に抑え、グリッド損傷の可能性を低減します。カプセルはピペットチップと同じ方法でシングルまたはマルチチャンネルのピペットに直接取り付けられ、さまざまな液体を内部のグリッドに塗布することができます。これにより、重複したグリッドで複数のサンプルを同時に作成することができます（ 図1B ）。カプセルで陰性染色するには、ウイルス試料をカプセル内に吸引し、ウイルスをグリッド表面に吸着させるために10分間保持する。その後、吸着したウイルスを含むグリッドを脱イオン（dI）水で洗浄し、UAまたはPTAのいずれかで数秒〜1分間染色する。このプロセスは、手動液滴法と同じプロトコールステップおよび試薬を用いる。違いはグリッドを物理的に扱うことなくカプセル内ですべての作業が行われることです。 （ 図1C 、1D ）。
この研究の目的は、生物学的環境におけるウイルスサンプルのネガティブ染色の新しい方法です。この研究はまた、2つの異なるウイルス不活性化手順、すなわち1％の四酸化オスミウム蒸気による急速な不活性化、および2％のグルタルアルデヒドによる24時間の不活性化から生成されたTEM画像の質を調べた。これらの両方をカプセルを用いて実施した。最後に、本発明者らは、カプセルに使用するために、一般的に使用される2つの陰性染色であるUAおよびPTAを評価した。 13
Protocol
Representative Results
Discussion
陰性染色は、ウイルス、タンパク質複合体およびナノ粒子を評価およびサイジングするための貴重なTEM技術である。試薬からネガチブへのグリッドの手動移動によるこれらの標本の液滴調製は、半世紀以上にわたり古典的なプロトコールであった。それは簡単なプロセスですが、成功裏に修了するためには訓練を通じて得られた専門知識が必要です。優秀なネガティブ染色は、依然として最?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
精製エボラナノVLP、Chikungunyaウイルスを提供するRajini Mudhasani博士、Ebolavirus糖タンパク質を発現するMurine Leukemia VLPを提供するCharles博士（Jason）Shoemaker博士に感謝し、感謝したいと思います。また、夏期インターンシッププログラム（SIP）や科学・工学修習プログラム（SEAP）、キャサリン・ヴィルヘルムセン博士のラボ安全教育のために、MAJ Carl Sofflerに感謝したいと思います。
Materials
| Formvar/carbon coated TEM grids | SPI | 3420C-MB | 200 mesh Cu Pk/100 |
| mPrep/g capsules | EMS | 85010-01 | box |
| mPrep/g couplers | EMS | 85010-11 | standard 16/Pk |
| glutaraldehdyde | EMS | 16320 | 50% solution, EM grade |
| Osmium Tetroxide | EMS | 19190 | 4% aqueous solution |
| Uranyl Acetate | EMS | 22400 | powder |
| Potassium phosphotungstic acid | EMS | 19500 | powder |
| filter paper | Whatman | 1450-090 | size 50 |
| Tranmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1011 | TEM |
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