Att upprätthålla Aedes aegypti myggor infekterade med Wolbachia
Summary
Aedes aegypti myggor infekterade med Wolbachia släpps in i naturliga populationer att dämpa överföringen av arboviruses. Vi beskriva metoder till bakre Ae. aegypti med Wolbachia infektioner i laboratorium för experiment och fältet release, vidta försiktighetsåtgärder för att minimera laboratorium anpassning och urval.
Abstract
Aedes aegypti myggor experimentellt infekterade med Wolbachia utnyttjas i program för att kontrollera spridningen av arboviruses såsom Zika, denguefeber och chikungunya. Wolbachia-infekterade myggor kan släppas ut i fältet antingen minska befolkningen storlekar genom oförenliga parningar eller att omvandla populationer med myggor som är refraktära mot virus överföring. För dessa strategier för att lyckas, måste myggen släpps ut i fältet från laboratoriet vara konkurrenskraftiga med infödda myggor. Dock kan att upprätthålla myggor i laboratoriet resultera i inavel, genetisk drift och laboratorium anpassning som kan minska deras lämplighet i fältet och kan blanda ihop resultaten av experiment. För att testa lämpligheten av olika Wolbachia infektioner för distribution i fältet, är det nödvändigt att bibehålla myggor i kontrollerad laboratoriemiljö över flera generationer. Vi beskriver ett enkelt protokoll för att upprätthålla Ae. aegypti myggor i laboratoriet, som är lämplig för både Wolbachia-infekterade och vildtyp myggor. Metoderna minimera laboratorium anpassning och genomföra korsningar för att öka relevansen av experiment fältet mygg. Dessutom bibehålls kolonier under optimala förhållanden att maximera deras lämplighet för öppna fältet utgåvor.
Introduction
Aedes aegypti myggor är ansvarig för att överföra några av de viktigaste arboviruses i världen, inklusive Zika, denguefeber och chikungunya1. Dessa virus blir ett allt större hot mot global hälsa eftersom de omfattande distributionen av Ae. aegypti i tropikerna fortsätter att expandera2,3,4. Kvinnliga Ae. aegypti livnär prioriterat sig på människoblod5 och därmed tenderar att leva i nära närhet till människor, särskilt i stadsområden där populationer är mest tät. Genom detta nära samarbete med människor har de också anpassade för att häcka i konstgjorda livsmiljöer, inklusive däck, krukor, rännor och vatten tankar6,7. AE. aegypti också lätt anpassa sig till laboratoriemiljöer där de kan upprätthållas utan särskilda krav efter samlas in direkt från fältet, till skillnad från vissa andra arter i Aedes släkte8, 9,10. Deras enkelt underhåll har sett dem studerade allmänt i laboratorium i ett brett spektrum av områden, i slutändan syftar till att kontrollera sjukdomar myggor kan överföra.
Traditionellt har beroende arboviral kontroll starkt av användning av insekticider att minska mosquito populationer. Dock finns det ökande intresse för metoder där modifierade myggor är uppfödda i laboratoriet och sedan släpps ut i naturliga populationer. Släppta myggor kan modifieras genetiskt11,12,13, biologiskt14,15, genom bestrålning16, kemisk behandling17,18, eller med kombinerade tekniker19 för att undertrycka populationer av myggor eller ersätta dem med myggor som är refraktära mot arboviral överföring20.
Wolbachia är bakterier som används för närvarande som en biologisk kontroll agent för arboviruses. Flera stammar av Wolbachia infördes nyligen i Ae. aegypti experimentellt med hjälp av embryonala Mikroskop21,22,23,24. Dessa stammar minska kapaciteten för arboviruses att sprida och replikera i mygga, minskar deras överföring potentiella23,25,26,27,28 . Wolbachia infektioner överförs från mor till avkomman, men vissa stammar inducera sterilitet när infekterade hanar parar sig med icke-infekterade kvinnor22. Wolbachia-infekterade män kan därför släppas i stora mängder för att undertrycka naturliga mygga populationer, som nyligen visat i andra Aedes arter15,29. Dock eftersom Wolbachia också hämma arboviral överföring i Ae. aegypti, kan myggor också frigöras för att ersätta inhemska bestånd med fattigare vektorer. Ae. aegypti experimentellt infekterade med Wolbachia släpps nu i fältet i flera länder använder denna senare metoden14,30,31.
Wolbachia-baserade strategier för arboviral kontroll är beroende av en god förståelse av samspelet mellan Wolbachia, mygga och miljö. Wolbachia förekommer naturligt i en rad insekter och de stammar som införs i myggor är olika i deras effekter32. Eftersom nya Wolbachia infektion typer förs in Ae. aegypti24, är det nödvändigt att karakterisera varje stam för sina effekter på mosquito fitness, reproduktion och arboviral störningar under en rad villkor. Rigorösa experiment i laboratoriet är därför nödvändigt att utvärdera potentialen för Wolbachia stammar att lyckas i fältet.
Öppna fältet utgåvor av Ae. aegypti med Wolbachia infektioner kan ofta kräva tusentals till tiotusentals myggor per utgåva zon vara uppfödda varje vecka14,30,31. Framgången för första utgåvor kan förbättras genom att släppa myggor av en stor storlek för att maximera sin fruktsamhet33 och parning framgång34,35. Myggor bör också anpassas till de förhållanden som de kommer att uppleva i fältet, men långsiktigt laboratorium uppfödning kan orsaka förändringar i beteende och fysiologi som kan påverka området prestanda36,37, 38.
Vi beskriver ett enkelt protokoll för uppfödning Ae. aegypti i laboratorium med hjälp av grundläggande utrustning. Detta protokoll är lämplig för både vildtyp och Wolbachia-infekterade myggor, den senare som kan kräva särskild uppmärksamhet eftersom vissa Wolbachia stammar har betydande effekter på mosquito livshistoria drag39, 40. uppfödning villkoren undvika överbefolkning och konkurrens om mat att producera myggor av konsekvent storlek, vilket är avgörande för vektor kompetens och lämplighet experiment, och säkerställer att myggen är friska för fältet övergång41 . Vi också vidta försiktighetsåtgärder för att minimera laboratorium anpassning och inavel genom att minska selektiva påtryckningar och att se till att nästa generation samplas från en stor, slumpmässiga pool. Men laboratoriemiljöer skiljer sig tydligt från fältförhållanden och långsiktigt underhåll under avslappnade förhållanden kunde minska av myggor vid utsättning i fält37,42,43 lämplighet . Vi därför passera honor från laboratoriet linjer till fältet-samlat män regelbundet, vilket resulterar i kolonier som är genetiskt lika för experimentell jämförelser och som är anpassade till de mål fältet befolkningen39. Metoderna kräver inte någon specialiserad utrustning och kan skalas upp till bakre tiotals tusentals individer per vecka för fältet utgåvor. Protokollet prioriterar också lämplighet myggor inom och mellan generationer, en viktig faktor för insekter som är avsedda för etablering i naturliga populationer. Protokollet är lämplig för de flesta laboratorier som kräver underhåll av Ae. aegypti, särskilt för experimentell jämförelser där en konsekvent kvalitet av myggor och relatability till fältet är viktiga.
Protocol
Representative Results
Discussion
Efter protokollet presenteras här för underhåll av Wolbachia-infekterade Ae. aegypti bör säkerställa att friska myggor av en konsekvent kvalitet produceras för experiment och öppna fältet utgåvor. I motsats till andra protokoll som prioriterar produktionen av massa mängder mygg (se referens57), är metoderna inriktade på att maximera deras fitness, både inom generationer av avslappnad uppfödning genomförandevillkor, och över generationer genom att minimera inavel,…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner Heng Lin Yeap, Chris Paton, Petrina Johnson och Clare Doig för deras bidrag till utvecklingen av vår koloni underhåll metoder och tre anonyma recensioner för deras förslag som bidrog till att förbättra manuskriptet. Vår forskning stöds av ett program grant och gemenskap till AAH från National Health och medicinska forskningsrådet och en översättning bevilja från Wellcome Trust. PAR är en mottagare av en australiensisk regering forskning utbildning Program stipendium.
Materials
| Wild type Aedes aegypti | Collected from field locations in Queensland, Australia, see Yeap and others39 for details | ||
| w Mel-infected Aedes aegypti | Provided by Monash University. Refer to Walker and others23 for information on the strain | ||
| w AlbB-infected Aedes aegypti | Provided by Monash University. Refer to Xi and others21 for information on the strain | ||
| w MelPop-infected Aedes aegypti | Provided by Monash University. Refer to McMeniman and others22 for information on the strain | ||
| Instant dried yeast | Lowan | Stimulates egg hatching. Found in general grocery stores. Other brands may be used | |
| 5 L plastic tub | Quadrant | Q110950 | Used for hatching and rearing larvae. Other products may be used |
| Fish Food (Tetramin Tropical Tablets) | Tetra | 16152 | Provided to larvae as a source of food. Web address: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE |
| Plastic containers | Used for rearing larvae. Any plastic container above 500 mL should be suitable | ||
| Glass pipette | Used for transferring larvae and pupae between containers. Web address: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez | ||
| Clicker counter | RS Pro | 710-5212 | Used to assist in the counting of larvae, pupae and eggs. Web address: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y |
| Rearing trays | Gratnells | Used for rearing larvae. Web address: http://www.gratnells.com | |
| Nylon mesh | Used to transfer larvae and pupae to containers of fresh water. Other brands may be used. Web address: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white | ||
| Cages | BugDorm | DP1000 | Houses adult mosquitoes. Alternative products may be used. Web address: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html |
| 35 mL plastic cup | Huhtamaki | AA272225 | Used to provide water or sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used |
| 35 mL plastic cup lid | Huhtamaki | GB030005 | Used to provide sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used |
| Cotton wool | Cutisoft | 71841-13 | Moist cotton wool is provided as a source of water to adults. Other brands may be used |
| White Sugar | Provided as a source of sugar to adult mosquitoes. Found in general grocery stores | ||
| Rope | M Recht Accessories | C323C/W | Used to provide sucrose solution to adults. Other brands may be used. Web address: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/ |
| Plastic cup (large) | Used as an oviposition container. Any plastic cup that holds 100 mL of water should be suitable | ||
| Sandpaper | Norton Master Painters | CE015962 | Provided as an oviposition substrate. Alternative products may be used, but we use this brand because it is relatively odorless. Lighter colors are used for contrast with eggs. Web address: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html |
| Filter paper | Whatman | 1001-150 | Used as an alternative oviposition substrate. Other brands may be used |
| Latex gloves | SemperGuard | Z560979 | Prevents mosquito bites on hands when blood feeding. Other brands may be used. Web address: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/ |
References
- Mayer, S. V., Tesh, R. B., Vasilakis, N. The emergence of arthropod-borne viral diseases: A global prospective on dengue, chikungunya and zika fevers. Acta Trop. 166, 155-163 (2017).
- Campbell, L. P., et al. Climate change influences on global distributions of dengue and chikungunya virus vectors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370 (1665), (2015).
- Kraemer, M. U., et al. The global distribution of the arbovirus vectors Aedes aegypti and Ae. albopictus. eLife. 4, (2015).
- Carvalho, B. M., Rangel, E. F., Vale, M. M. Evaluation of the impacts of climate change on disease vectors through ecological niche modelling. Bull Entomol Res. , 1-12 (2016).
- Scott, T. W., et al. Longitudinal studies of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in Thailand and Puerto Rico: population dynamics. J Med Ent. 37 (1), 77-88 (2000).
- Cheong, W. Preferred Aedes aegypti larval habitats in urban areas. Bull World Health Organ. 36 (4), 586-589 (1967).
- Barker-Hudson, P., Jones, R., Kay, B. H. Categorization of domestic breeding habitats of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in Northern Queensland, Australia. J Med Ent. 25 (3), 178-182 (1988).
- Watson, T. M., Marshall, K., Kay, B. H. Colonization and laboratory biology of Aedes notoscriptus from Brisbane, Australia. J Am Mosq Control Assoc. 16 (2), 138-142 (2000).
- Williges, E., et al. Laboratory colonization of Aedes japonicus japonicus. J Am Mosq Control Assoc. 24 (4), 591-593 (2008).
- Munstermann, L. E. . The Molecular Biology of Insect Disease Vectors. , 13-20 (1997).
- McDonald, P., Hausermann, W., Lorimer, N. Sterility introduced by release of genetically altered males to a domestic population of Aedes aegypti at the Kenya coast. Am J Trop Med Hyg. 26 (3), 553-561 (1977).
- Rai, K., Grover, K., Suguna, S. Genetic manipulation of Aedes aegypti: incorporation and maintenance of a genetic marker and a chromosomal translocation in natural populations. Bull World Health Organ. 48 (1), 49-56 (1973).
- Harris, A. F., et al. Field performance of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnol. 29 (11), 1034-1037 (2011).
- Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).
- O’Connor, L., et al. Open release of male mosquitoes infected with a Wolbachia biopesticide: field performance and infection containment. PLoS Negl Trop Dis. 6 (11), e1797 (2012).
- Morlan, H. B. Field tests with sexually sterile males for control of Aedes aegypti. Mosquito news. 22 (3), 295-300 (1962).
- Grover, K. K., et al. Field experiments on the competitiveness of males carrying genetic control systems for Aedes aegypti. Entomol Exp Appl. 20 (1), 8-18 (1976).
- Seawright, J., Kaiser, P., Dame, D. Mating competitiveness of chemosterilized hybrid males of Aedes aegypti (L.) in field tests. Mosq News. 37 (4), 615-619 (1977).
- Zhang, D., Lees, R. S., Xi, Z., Gilles, J. R., Bourtzis, K. Combining the sterile insect technique with Wolbachia-based approaches: II- a safer approach to Aedes albopictus population suppression programmes, designed to minimize the consequences of inadvertent female release. PloS One. 10 (8), e0135194 (2015).
- McGraw, E. A., O’Neill, S. L. Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem. Nature Rev Microbiol. 11 (3), 181-193 (2013).
- Xi, Z., Khoo, C. C., Dobson, S. L. Wolbachia establishment and invasion in an Aedes aegypti laboratory population. Science. 310 (5746), 326-328 (2005).
- McMeniman, C. J., et al. Stable introduction of a life-shortening Wolbachia infection into the mosquito Aedes aegypti. Science. 323 (5910), 141-144 (2009).
- Walker, T., et al. The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations. Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).
- Joubert, D. A., et al. Establishment of a Wolbachia superinfection in Aedes aegypti mosquitoes as a ppotential approach for future resistance management. PLoS Pathog. 12 (2), e1005434 (2016).
- Ferguson, N. M., et al. Modeling the impact on virus transmission of Wolbachia-mediated blocking of dengue virus infection of Aedes aegypti. Sci Transl Med. 7 (279), 279ra237 (2015).
- Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia Reduces Transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Sci Rep. 6, 28792 (2016).
- van den Hurk, A. F., et al. Impact of Wolbachia on infection with chikungunya and yellow fever viruses in the mosquito vector Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 6 (11), e1892 (2012).
- Moreira, L. A., et al. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium. Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).
- Mains, J. W., Brelsfoard, C. L., Rose, R. I., Dobson, S. L. Female Adult Aedes albopictus Suppression by Wolbachia-Infected Male Mosquitoes. Sci Rep. 6, 33846 (2016).
- Nguyen, T. H., et al. Field evaluation of the establishment potential of wmelpop Wolbachia in Australia and Vietnam for dengue control. Parasit Vectors. 8, 563 (2015).
- Garcia Gde, A., Dos Santos, L. M., Villela, D. A., Maciel-de-Freitas, R. Using Wolbachia releases to estimate Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) population size and survival. PloS One. 11 (8), e0160196 (2016).
- Hoffmann, A. A., Ross, P. A., Rašić, G. Wolbachia strains for disease control: ecological and evolutionary considerations. Evol Appl. 8 (8), 751-768 (2015).
- Briegel, H. Metabolic relationship between female body size, reserves, and fecundity of Aedes aegypti. J Insect Physiol. 36 (3), 165-172 (1990).
- Ponlawat, A., Harrington, L. C. Factors associated with male mating success of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. Am J Trop Med Hyg. 80 (3), 395-400 (2009).
- Segoli, M., Hoffmann, A. A., Lloyd, J., Omodei, G. J., Ritchie, S. A. The effect of virus-blocking Wolbachia on male competitiveness of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3294 (2014).
- Imam, H., Zarnigar, G., Sofi, A., Seikh, The basic rules and methods of mosquito rearing (Aedes aegypti). Trop Parasitol. 4 (1), 53-55 (2014).
- Spitzen, J., Takken, W. Malaria mosquito rearing-maintaining quality and quantity of laboratory-reared insects. Proc Neth Entomol Soc Meet. 16, 95-100 (2005).
- Lorenz, L., Beaty, B. J., Aitken, T. H. G., Wallis, G. P., Tabachnick, W. J. The effect of colonization upon Aedes aegypti susceptibility to oral infection with Yellow Fever virus. Am J Trop Med Hyg. 33 (4), 690-694 (1984).
- Yeap, H. L., et al. Dynamics of the "popcorn" Wolbachia infection in outbred Aedes aegypti informs prospects for mosquito vector control. Génétique. 187 (2), 583-595 (2011).
- Turley, A. P., Moreira, L. A., O’Neill, S. L., McGraw, E. A. Wolbachia infection reduces blood-feeding success in the dengue fever mosquito, Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 3 (9), e516 (2009).
- Yeap, H. L., Endersby, N. M., Johnson, P. H., Ritchie, S. A., Hoffmann, A. A. Body size and wing shape measurements as quality indicators of Aedes aegypti mosquitoes destined for field release. Am J Trop Med Hyg. 89 (1), 78-92 (2013).
- Leftwich, P. T., Bolton, M., Chapman, T. Evolutionary biology and genetic techniques for insect control. Evol Appl. 9 (16), 212-230 (2016).
- Calkins, C., Parker, A. . Sterile Insect Technique. , 269-296 (2005).
- Tun-Lin, W., Burkot, T., Kay, B. Effects of temperature and larval diet on development rates and survival of the dengue vector Aedes aegypti in north Queensland, Australia. Med Vet Entomol. 14 (1), 31-37 (2000).
- Richardson, K., Hoffmann, A. A., Johnson, P., Ritchie, S., Kearney, M. R. Thermal sensitivity of Aedes aegypti from Australia: empirical data and prediction of effects on distribution. J Med Ent. 48 (4), 914-923 (2011).
- Richardson, K. M., Hoffmann, A. A., Johnson, P., Ritchie, S. R., Kearney, M. R. A replicated comparison of breeding-container suitability for the dengue vector Aedes aegypti in tropical and temperate Australia. Austral Ecol. 38 (2), 219-229 (2013).
- Ross, P. A., et al. Wolbachia infections in Aedes aegypti differ markedly in their response to cyclical heat stress. PLoS Pathog. 13 (1), e1006006 (2017).
- Gjullin, C., Hegarty, C., Bollen, W. The necessity of a low oxygen concentration for the hatching of Aedes mosquito eggs. J Cell Physiol. 17 (2), 193-202 (1941).
- Axford, J. K., Ross, P. A., Yeap, H. L., Callahan, A. G., Hoffmann, A. A. Fitness of wAlbB Wolbachia infection in Aedes aegypti: parameter estimates in an outcrossed background and potential for population invasion. Am J Trop Med Hyg. 94 (3), 507-516 (2016).
- Degner, E. C., Harrington, L. C. Polyandry depends on postmating time interval in the dengue vector Aedes aegypti. Am J Trop Med Hyg. 94 (4), 780-785 (2016).
- Bentley, M. D., Day, J. F. Chemical ecology and behavioral aspects of mosquito oviposition. Ann Rev Entomol. 34 (1), 401-421 (1989).
- Wong, J., Stoddard, S. T., Astete, H., Morrison, A. C., Scott, T. W. Oviposition site selection by the dengue vector Aedes aegypti and its implications for dengue control. PLoS Negl Trop Dis. 5 (4), e1015 (2011).
- Meola, R. The influence of temperature and humidity on embryonic longevity in Aedes aegypti. Ann Entomol Soc Am. 57 (4), 468-472 (1964).
- Faull, K. J., Williams, C. R. Intraspecific variation in desiccation survival time of Aedes aegypti (L.) mosquito eggs of Australian origin. J Vector Ecol. 40 (2), 292-300 (2015).
- McMeniman, C. J., O’Neill, S. L. A virulent Wolbachia infection decreases the viability of the dengue vector Aedes aegypti during periods of embryonic quiescence. PLoS Negl Trop Dis. 4 (7), e748 (2010).
- Ross, P. A., Endersby, N. M., Hoffmann, A. A. Costs of three Wolbachia infections on the survival of Aedes aegypti larvae under starvation conditions. PLoS Negl Trop Dis. 10 (1), e0004320 (2016).
- Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. J Vis Exp. (83), e3579 (2014).
- Benedict, M. The first releases of transgenic mosquitoes: an argument for the sterile insect technique. Trends Parasitol. 19 (8), 349-355 (2003).
- Lee, S. F., White, V. L., Weeks, A. R., Hoffmann, A. A., Endersby, N. M. High-throughput PCR assays to monitor Wolbachia infection in the dengue mosquito (Aedes aegypti) and Drosophila simulans. Appl Environ Microbiol. 78 (13), 4740-4743 (2012).
- Corbin, C., Heyworth, E. R., Ferrari, J., Hurst, G. D. Heritable symbionts in a world of varying temperature. Heredity. 118 (1), 10-20 (2017).
- Day, J. F., Edman, J. D. Mosquito engorgement on normally defensive hosts depends on host activity patterns. J Med Ent. 21 (6), 732-740 (1984).
- Gonzales, K. K., Hansen, I. A. Artificial diets for mosquitoes. Int J Environ Res Public Health. 13 (12), (2016).
- McMeniman, C. J., Hughes, G. L., O’Neill, S. L. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti disrupts mosquito egg development to a greater extent when mosquitoes feed on nonhuman versus human blood. J Med Ent. 48 (1), 76-84 (2011).
- Caragata, E. P., Rances, E., O’Neill, S. L., McGraw, E. A. Competition for amino acids between Wolbachia and the mosquito host, Aedes aegypti. Microb Ecol. 67 (1), 205-218 (2014).
- Suh, E., Fu, Y., Mercer, D. R., Dobson, S. L. Interaction of Wolbachia and bloodmeal type in artificially infected Aedes albopictus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. , (2016).
- Thangamani, S., Huang, J., Hart, C. E., Guzman, H., Tesh, R. B. Vertical transmission of Zika virus in Aedes aegypti mosquitoes. Am J Trop Med Hyg. 95 (5), 1169-1173 (2016).
