פרוטוקול המעבדה הגנטית ניתוחים תוכן הבטן של הימית Macroinvertebrates באמצעות קבוצה ספציפית rDNA תחל

Summary

הנפוץ ביותר ניתוח תוכן הבטן של macroinvertebrates הם חזותיים. הדורשים ידע אינטנסיבי ונעשית מורפולוגי של אורגניזמים טרף, הם מתגעגעים טרף גוף רך, בשל comminution חזקה של טרף, הם כמעט בלתי אפשרית עבור אורגניזמים מסוימים, כולל amphipods. אנו מספקים נתונים היסטוריים, רומן גישות גנטיות עבור macroinvertebrate טרף זיהוי בתזונה של amphipods.

Abstract

ניתוח במארג המזון חיוני לצורך הבנה טובה יותר של מערכות אקולוגיות. לדוגמה, אינטראקציות מארג מזון יכול עוברים שינויים חמורה נגרמת על ידי הפלישה של מינים-ילידים. עם זאת, זיהוי מדויק של שדה טורף-טרף אינטראקציות קשה במקרים רבים. ניתוחים אלה לעיתים קרובות מבוססות על בדיקה חזותית של תוכן הבטן או הניתוח של יחסי איזוטופ יציב (אלפא¹⁵N ואלפא¹³ג). שיטות כאלה דורשים ידע מקיף, בהתאמה, גיוון מורפולוגיות או חתימה איזוטרופי של אורגניזמים טרף בודדים, שמוביל מכשולים הזיהוי המדויק של אורגניזמים טרף. ניתוח תוכן ויזואלי הבטן במיוחד לזלזל אורגניזמים טרף גוף רך, כי השרייה, שאורכה, בליעה, העיכול של אורגניזמים טרף להקשות זיהוי של מין מסוים. לפיכך, פולימראז תגובת שרשרת (PCR) המבוסס על אסטרטגיות, למשל השימוש של קבוצה ספציפית פריימר מגדיר, לספק כלי רב עוצמה עבור החקירה של אינטראקציות מארג מזון. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים מפורט כדי לחקור את תכולת הבטן הצרכנים macroinvertebrate מן השדה באמצעות פריימר המיועדות לקבוצות ערכות עבור גרעיני חומצה deoxyribonucleic 30s ריבוזומלי (rDNA). דנ א יכול להיות חילוץ או כל דגימות (במקרה של taxa קטנה) או מתוך הבטן התוכן של דגימות שנאספו בשטח. נוכחות ויעילות פונקציונלי של תבניות DNA צריך לאשר ישירות מן הפרט נבדק באמצעות פריימר אוניברסלי מגדיר פילוח של יחידת משנה בהתאמה של ה-DNA. אנחנו גם להוכיח כי טרף נצרך יכול להיקבע נוספת לרמה מינים באמצעות PCR עם תחל המיועדות לקבוצות שלא שונתה בשילוב עם גדיל אחד העוקבים קונפורמציה פולימורפיזם (SSCP) ניתוחים באמצעות ג’ל לזיהוי. יתר על כן, אנו מראים כי השימוש שונים צבעי פלורסנט כתוויות מאפשר הקרנה מקבילים של שברי DNA של קבוצות שונות טרף מדגימות מרובים בטן תוכן באמצעות ניתוח אוטומטיות רסיס.

Introduction

אינטראקציות טורף-טרף, המהווים את רוב האינטראקציות עם מחלות ואת הדינמיקה מארג מזון, הם היבטים מרכזיים כדי לאפיין את פלקסים של חומר ואנרגיה ברחבי במארג המזון בתוך ובין מערכות אקולוגיות, אשר אחת ממטרותיה העיקריות של אקולוגיה ¹. קביעת מקור וזרימה של פחמן וחומרים מזינים היא בהבנה של קישוריות אקולוגית בין מערכות אקולוגיות². עם זאת, מערכות אקולוגיות, כגון נהרות, catchments שלהם, לא רק מקושרים על ידי פלקסים של חומר אורגני וחומרים מזינים, אלא גם על ידי התנועות של אורגניזמים³. לפיכך, שינויים הגידול מפריע לזרם של משאבים לקשר מערכות אלה יכול בחום לשנות מזון באתרי אינטרנט של שתי מערכות אקולוגיות, לא רק ישירות אלא בעקיפין גם על-ידי שינוי ההרכב בהתאמה של קהילות טורף-טרף. למשל, שינויים של במארג המזון הוכחו להיות מקושר התנועות של מינים (למשל, פורל הקשת בענן) טורף יחיד⁴. שינויים כאלה שעלולים לאיים על המגוון הביולוגי לבין תפקוד המערכת האקולוגית הימית. לפיכך, ניתוח אינטראקציות טורף-טרף בשדה חיונית כדי לקבוע את ההשפעה של האדם-induced שינויים סביבתיים, כגון שיטות ניהול מים, על המגוון הביולוגי מקורית של המערכת האקולוגית הימית.

מאחר מעקב אחר קישורים עם מחלות קשות במערכות מורכבות, מספר גישות הוקמו המאפשרים את ההערכה של האכלה אינטראקציות שדה⁵. באופן מסורתי, חקירות של האכלה אינטראקציות בשדה מבוססים על זיהוי חזותי שרידי טרף במעיים ביתור ודורשים ידע נרחב על הטרף מורפולוגיות הגיוון. ניתוח תוכן ויזואלי בטן סיפקו תובנות על השימוש במשאבים של מספר קבוצות של צרכנים (למשל, וריאציה עונתיים בתזונה של לובסטר⁶ דגים^7,8 או האכלה והעדפות של משטרגליים). עם זאת, התהליך הפיזי של מערכת העיכול מקשה על ניתוח תוכן ויזואלי בטן ומתגעגעת בדרך כלל גוף רך טרף-אורגניזמים⁹. עבור מינים האכלה דרך בליעה נוזלי או כמה צרכני הגעה באופן אינטנסיבי comminute את האוכל שלהם לפני בליעה, כמו amphipods, זיהוי חזותי של הטרף מינים בתוכן הבטן הוא בלתי אפשרי¹⁰. בשל מגבלות אלו, אנליזה מולקולרית מספק אלטרנטיבה מבטיחה.

ניתוחים מולקולריים הפכו עתה כלי משותף המאפשר זיהוי מהיר ומדויק טרף בתכולת מעיים. מגוון טכניקות אלה הוא מגוונים: אסטרטגיות בהתבסס על נוגדנים חד-שבטיים או תגובות שרשרת של פולימראז (PCR) משמשים לעתים קרובות, בגלל שלהם גבוהה ירידה לפרטים ורגישות¹¹. הפיתוח של נוגדנים חד-שבטיים החדש ואת עלות-אינטנסיבית, לכן, היישום של טכניקות מולקולריות אחרות הוא יותר שימושי כאשר נוגדנים אינם קיימים כבר¹¹. גישה נפוצה אחרת היא ההגברה של מחוזות חומצה deoxyribonucleic (DNA), כמו חומצה ריבונוקלאית 30s ריבוזומלי (RNA) גנים נוכח רוב המינים, באמצעות פריימר אוניברסלי מגדיר^12,13. בעת שימוש בטכניקה זו, הוא לעתים קרובות לא ניתן לזהות מגוון רחב של אורגניזמים טרף בתוך מקורות מעורבות של הדנ א¹⁴. גישה יעילה כדי להימנע כזה חיסרון הוא להשתמש המיועדות לקבוצות פריימר מגדיר עבור ניתוח תוכן הבטן גנטי. שנועד להגביר רק DNA אזורים של קבוצות יעד מסוים או לא לכלול כל שאר המינים^15,16, המיועדות לקבוצות תחל להפעיל זיהוי של אורגניזמים טרף ברמה טקסונומי של הקבוצות שצוין ללא ניתוחים משניים של עלות-אינטנסיבית. עם זאת, כמו כל בטן ניתוח תוכן, ניתוח כזה מספקים רק תמונה של האכלה התנהגות. לכן, שילוב של ניתוח תוכן הבטן מולקולרית עם ניתוחים של שילוב זמן המשדרים טבעי (למשל, איזוטופים היציבים) נחשב מועיל^1,2.

כאן, אנו מתארים שיטה מפורטת חקירות מבוסס ה-PCR של טורף-טרף אינטראקציות באמצעות פריימר המיועדות לקבוצות ערכות עבור גרעיני ribosomal DNA (rDNA) אזורים להיות משולבת עם איזוטופ יציב ניתוחים של הדגימה זהה. אנו מתארים את הגילוי של ה-DNA של קבוצות טרף יחיד באמצעות agarose בג’ל. בנוסף, אנו מציגים הזדמנות נוספת במורד הזרם ניתוחים של מוצרי ה-PCR תחל המיועדות לקבוצות כזה ישים בכל פעם בטקסונומיה ברזולוציה גבוהה יותר מאשר ירידה לפרטים תחל נדרש. כי הדנ א נטושים יחיד (ssDNA) קטעים טופס שלישוני הייצורים החיים שנקבעות על-ידי רצף העיקרי שלהם¹⁷, וריאציות קטנות בתוך שברי מוגבר על ידי תחל המיועדות לקבוצות כאלה להוביל שינויים הסתגלותי. שינויים כאלה יכולים יזוהו על-ידי צירוף יחיד קונפורמציה פולימורפיזם (SSCP) ניתוחים עם ג’לים לזיהוי^17,18, מתן אפשרות של זיהוי מדויק יותר של הטרף אורגניזמים (עד לרמת מינים).

בעוד agarose בג’ל הוא כלי נפוץ וזול כדי להמחיש שברי DNA ולקבוע שלהם אורך משוער¹⁹, הרזולוציה תלוי בכמות ה-DNA ומשמש לצבוע מכתימים²⁰. בדרך כלל, הפריט החזותי הוא ישר קדימה בעת עבודה עם דגימות דנ א טהור, אבל כמויות נמוכות באופן פוטנציאלי של הטרף DNA בתוכן הבטן של הצרכנים יכול לסבך על מניה של agarose ג’ל אלקטרופורזה תוצאות. עדיין, זיהוי שיטה זו אפשרית על המסך מספר נמוך של הצרכן דגימות מן השדה עבור אחד או כמה טרף קבוצות, אך סיבוך על מניה גורם ההקרנה של מספר רב של דוגמאות taxa טרף מרובות מאוד זמן אינטנסיבית ובכך אכן. שיטת זיהוי רגיש יותר הוא ניתוח אוטומטיות של קטעים באמצעות אלקטרופורזה נימי, אשר בנוסף מאפשר קביעת האורך המדויק של שברי²¹. מספר microsatellite המבוסס על מחקרים הראו כי באמצעות צבעי פלורסנט שונים כמו תוויות, זה אפשרי ויוכל לקבוע שברים שונים של אורך דומות על ידי אוטומטיות רסיס ניתוח^{22,23, 24}. לכן, אנו מציגים גם פרוטוקול מפורט לצורך זיהוי מקבילים של ה-DNA של הטרף מרובים באמצעות PCR עם תוויות ייחודיות לקבוצה פריימר ערכות זיהוי באמצעות ניתוח אוטומטיות רסיס עם ברצף אוטומטיות קבוצות. בנוסף, אנו מציגים תוצאות של חקר מקרה הממחיש זיהוי ה-DNA טרף באמצעות ניתוח אוטומטיות רסיס היא גישה המאפשרת גם על כימות היחסי של הטרף בלע.

Protocol

1. לאסוף Macroinvertebrates מהשדה ולהכין את הדגימות ניתוח תוכן הבטן גנטי. Macroinvertebrates לאסוף בכל אתר, למיין ליחידים של הצרכן מין עניין לתוך צינורות יחיד, ומקפיאים ישירות חנקן נוזלי או קרח יבש כדי למנוע בטן סיווג והשפלה של דנ א. הערה: הימנע משמירת דגימות של האלכוהול, macroinvertebrates מסוימים נוטים להק…

Representative Results

השתמשנו בהצלחה את השלבים המתוארים בפרק זה פרוטוקול דיאטה ניתוחים במסגרת מחקרים שונים. בחלק זה, אנו מציגים דוגמאות המתארות את הישימות של הסעיפים השונים של הפרוטוקול. לדוגמה, כדי להדגים את היעילות של קבוצות ייחודיות לקבוצה פריימר נוסדה על …

Discussion

כאן, אנו מציגים שיטה קלה וחסכונית עבור נחישות מבוססי ה-PCR של טורף-טרף אינטראקציות מדגימות שדה באמצעות תחל קבוצה ספציפית עבור אזורים rDNA, אשר יכול להיות משולב עם אחרים ניתוחים שאינם-מולקולרית של דגימות באותו. עם זאת, ישנם מספר שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול. ראשית, שמבטיח יחודיות של תחל שימוש ח?…

Materials

liquid nitrogen	Any	NA	For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory.
1.5 ml reaction tubes – Safelock	Any	NA	For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle.
Stereomicroscope	Any	NA	Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest.
Petri dishes	Any	NA	To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope.
Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7	Bioform	B40d	This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract.
Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5	Bioform	B40b	This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens.
DNA-ExitusPlus	AppliChem	A7409,1000RF	Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations
fuzz-free paper towel	Any	NA
Lab scale	Any	NA	Precision needs to be at least 0.01 g.
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL)	Any	NA
Safe-Lock Tubes 2.0 ml	VWR	211-2165	It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!
Safe-Lock Tubes 1.5 ml	VWR	211-2164	It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!
Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO	carlroth	3957.3	For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA.
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris	carlroth	4855.2	For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL)	carlroth	8043.1	For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer
Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO	carlroth	6943.2	For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained.
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	carlroth	4360.1	For extraction of DNA
Proteinase K lyophil.	carlroth	7528.1	Prepare a working solution containing 10 mg/ml.
TissueLyser II	Quiagen	85300	Bead mill for homogenization of the samples.
Stainless Steel Beads, 5 mm	Quiagen	69989	For homogenization of samples.
Heating Thermoshaker	Any	NA
Vortex Mixer	Any	NA
Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE	Hitachi	NA	Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1).
Isopropanol	carlroth	6752.5
Ethanol 99.8 %, p.a.	Any	NA
Water Molecular biology grade (ddH2O)	AppliChem	A7398,1000	nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript
Unmodified Olegonucleotides	Eurofins MWG Operon	NA	Primers unlabeled
Modified olegonucleotides	Metabion International AG	NA	Primers labelled
peqGOLD Taq all inclusive	VWR Peqlab	01-1000	Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2)
Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient	Peqlab	NA	Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine.
Standard 96 Well PCR Plates	VWR Peqlab	732-2879	Used for PCR reactions.
Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes	VWR Peqlab	732-3223	Cap stripes used to close the PCR plates.
Agarose	Peqlab	35-1020	Used for gel electrophoresis.
Microwave	Any	NA
Conical flask	Any	NA
Measuring cylinder	Any	NA
Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth	Any	NA	For agarose gel electrophoresis.
Electrophoresis Power Supply PS3002	Life Technologies	NA
Ethidium bromide solution 1 %	carlroth	2218.1	Used to prepare staining bath for agarose gels.
Formamide	carlroth	6749.1	Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses.
Bromphenol blue	AppliChem	A3640.0010	Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.
Sucrose	carlroth	4621.1	Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.
100 bp-DNA-Ladder extended	carlroth	T835.1	As size standard for agarose gel electrophoresis.
UV-Documentation system	Any	NA	To visualize gel electrophoresis results.
Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1)	carlroth	A121.1	For the preparation of polyacrylamid gels.
Ammonium peroxydisulphate	carlroth	9592.2	For the preparation of polyacrylamid gels.
foldback clips (32 mm)	Any	NA	For the preparation of polyacrylamid gels.
square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm)	Any	NA	For the preparation of polyacrylamid gels.
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	carlroth	23.67.1	For the preparation of polyacrylamid gels.
Beaker	Any	NA
RC 10 Digital chiller	VWR	462-0138	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems)	VWR	700-2361	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Notched glass plate	VWR	730-0261	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Blank glass plate	VWR	730-0260	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Spacers	VWR	730-0262	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Comb with 25 teeth	VWR	730-0294	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Shaking platform	Any	NA	For constant shaking of the staining bath.
GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.)	Biozym	850535 (50535)	For staining of polyacrylamide gels.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp	AB Sciex	608098	For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp	AB Sciex	608095	For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A.
Sample Loading Solution (SLS)	AB Sciex	608082	For automated fragment analyses.
Sequenzing plate – 96 Well Polypropylene PCR Microplate	Costar	6551	For automated fragment analyses.
Plate centrifuge, PerfectSpin P	VWR Peqlab	NA	mini plate centrifuge used to spin down PCR products.
Buffer plate – 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate	Corning	9017	For automated fragment analyses.
GenomeLab Seperation buffer	AB Sciex	608012	For automated fragment analyses.
Separation Gel – LPAI	AB Sciex	608010	For automated fragment analyses.
Sequenzer – CEQ8000 Genetic Analysis System	Beckman Coulter	NA	For automated fragment analyses.
GeneMarker V1.95	Softgenetics	NA	To analyze results of automated fragment analyses.