水生動物使用グループ固有の rDNA プライマーの遺伝的腸内容分析の研究プロトコル

Summary

動物の最も一般的な腸内容の分析は、視覚的な。餌生物の形態の多様性についての強烈な知識を必要とする、彼ら柔らかい bodied 獲物を逃すし、獲物の強力な粉砕により、ヨコエビ類を含むいくつかの生物はほぼ不可能。昆虫の詳細な斬新な遺伝的アプローチ獲物ヨコエビの国会で身分証明書を提供します。

Abstract

食物網の分析は、生態系の理解を深めるために不可欠です。たとえば、食物網の相互作用は、非在来種の侵入によって引き起こされる深刻な変更を受けることができます。ただし、フィールドの捕食者-被食者相互作用の正確な同定は多くの場合困難であります。これらの分析は、腸内容の視覚的評価や安定同位体比 (δ¹⁵N そして δ¹³C) の分析にしばしば基づいています。形態学上の多様性や捕食生物の正確な同定の障害につながる、個々 の餌生物から同位体署名このようなメソッドは、それぞれ、包括的な知識を必要です。浸軟、経口摂取と餌生物の消化によって特定の種の同定困難ため visual 腸内容分析は特に柔らかい bodied 餌生物を過小評価します。したがって、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) による戦略、たとえばグループ特定のプライマー セットを使用、食物網の相互作用の調査のための強力なツールを提供します。ここでは、核リボソーム デオキシリボ核酸 (rDNA) のグループ特定のプライマー セットを使用してフィールドから消費者を昆虫の消化管内容物を調査するための詳しいプロトコルについて述べる。DNA がすることができます (小分類) の場合全体の標本から抽出またはフィールドの標本の消化管内容物から。存在と DNA のテンプレートの機能の効率テスト個人から直接確認する必要がある普遍的なプライマーを用いた DNA のそれぞれのサブユニットをターゲットに設定します。また、ポリアクリルアミドのゲルを使用して後続の一本鎖コンフォメーション sscp 解析と変更されていないグループ固有のプライマーと PCR によって種レベルまでさらに組み合わせて消費獲物を定めることができることを示します。さらに、ラベルとして異なった蛍光染料の使用できる並列スクリーニング自動化されたフラグメント解析による複数の腸コンテンツ サンプルから別の獲物グループの DNA のフラグメントを示す.

Introduction

栄養相互作用と食物網動態の大半を占める捕食者-被食者の相互作用、物質と食物網内および生態学の主要な目標の 1 つである生態系間を通してエネルギーのフラックスを特徴付ける重要な側面¹。 ソースの決意と炭素と栄養素の流れは生態系²間の生態的結合の理解を促進します。ただし、有機物および栄養素のフラックスも生物³の動きには、川などの流域の生態系はだけはリンクされません。したがって、これらのシステムをリンクしているリソースの流れを中断する生息地の変化強く変更できます両方生態系の食物網だけでなく直接、また、間接的捕食者-被食者コミュニティのそれぞれの構成を変更することによって。たとえば、単一の捕食者の種 (例えばニジマス)⁴の動きにリンクする食物網の変化が示されています。このような変更は潜在的生物多様性と水界生態系の機能を脅かします。したがって、フィールドにおける捕食者-被食者の相互作用の分析水生生態系のネイティブの生物多様性、水管理など、人為的な環境変化の影響を判断することが不可欠です。

栄養連携を追跡は複雑なシステムで難しいので、フィールド⁵の相互作用の評価を有効にするいくつかのアプローチを確立されています。従来、供給分野における相互作用の調査は切り裂かれた根性のままに獲物の視覚的な識別に基づいています、獲物の形態学的多様性に関する広範な知識を必要とします。視覚的腸内容分析は消費者 (例えばの季節変動ダイエット ロブスター⁶魚^7,8または餌の好みのカイアシ類) のいくつかのグループのリソースの使用に洞察力を提供しています。ただし、消化の物理的なプロセスは visual 腸内容分析を困難、通常柔らかい bodied 獲物生物⁹をミスします。種の液体摂取によって餌または集中的に摂取、ヨコエビ類のような前に餌を comminute いくつかの無脊椎動物の消費者のため消化管内容物の餌種の視覚的な識別は不可能¹⁰です。これらの制限のための分子解析は、有望な代替手段を提供します。

分子解析は、消化管内容物の迅速かつ的確な獲物の検出を許可する一般的なツールとなっています。このような技術の範囲は多様な: モノクローナル抗体またはポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) に基づく戦略頻繁にされる、彼らの高い特異性と感度¹¹のため。新しいモノクローナル抗体の開発は時間とコストがかかる、抗体が¹¹を既に存在しない場合したがって、他の分子技術の応用はより便利です。デオキシリボ核酸 (DNA) のように普遍的なプライマーを使用して、ほとんどの種で現在の ribosomal リボ核酸 (RNA) 遺伝子の領域の増幅は^12,13を設定する一般的な方法です。この手法を使用して、頻繁にしない DNA¹⁴の混在のソース内の餌生物の全範囲を特定することが可能です。このような欠点を避けるために効果的な方法は、グループ特定のプライマーを使用する遺伝的腸内容分析の設定です。特定のターゲット グループの DNA 領域だけを増幅し、すべて他種^15,16を除外するように設計、グループ特定のプライマーはせず指定したグループの分類学的レベルの餌生物の同定を有効にします。時間とコストのかかる二次分析。ただし、すべての腸の内容分析のようなそのような分析は摂食行動のスナップショットのみを提供します。したがって、自然なトレーサーの時間統合 (例えば、安定同位体) の解析と分子腸内容分析を組み合わせると、有益な^1,2と見なされます。

ここでは、PCR に基づく調査核リボソーム DNA (rDNA) 領域のグループ特定のプライマー セットを使用した同じ試料の安定同位体比分析と組み合わせること捕食者-被食者の相互作用の詳細な方法について述べる。Agarose のゲルの電気泳動で単一獲物グループの DNA の検出について述べる。また、プライマーの特異性より高い分類の解像度が必要なときに該当するようなグループ固有プライマーの PCR 産物のさらに下流解析のための機会を紹介します。単一鎖 DNA (ssDNA) フラグメント フォーム第三構造の一次配列¹⁷によって決定される、ためこのようなグループに固有のプライマーによって増幅断片の小さな変化は構造変化に します。このような変更は、ポリアクリルアミドゲル^17,18, (種レベル) の摂餌生態のより正確な識別を有効にすると一本鎖コンフォメーション sscp 解析によって検出できます。

Agarose のゲルの電気泳動は DNA のフラグメントを視覚化し、おおよその長さ¹⁹、解像度を決定する一般的で安価なツールは DNA の量に依存し、染色染料使用²⁰。通常、可視化はまっすぐ進む純粋な DNA のサンプルを使用する場合、獲物の少ない潜在的消費者の消化管内容物の DNA、agarose のゲルの電気泳動の結果の得点が複雑に。まだ、この検出方法は画面の 1 つのフィールドから消費者の標本数が少ないことは不可能またはいくつか獲物のグループが、得点の合併症なりますサンプル数が高いスクリーニング複数獲物イチイは非常に時間の集中的なとこの実行不可能。高感度の検出法は、さらにフラグメント²¹の正確な長さの定量を可能にするキャピラリー電気泳動によるフラグメントの自動分析です。ラベルとして異なった蛍光染料を使用して、検出および自動フラグメント解析^{22,23で対等な長さのさまざまな断片を判断をすることが可能があることいくつかのマイクロ サテライトによる研究を示した 24}。したがって、また提案する複数の獲物から DNA の並列検出のための詳しいプロトコル ラベル グループ特定のプライマー セットと自動シーケンサーによる自動フラグメント解析による検出 PCR を使用してグループ。さらに、自動化されたフラグメント解析による獲物の DNA の検出がまた摂取した獲物の相対的な定量化を可能にするアプローチであることを示す事例から結果を報告する.

Protocol

1 ですフィールドから動物を収集し、遺伝子の腸内容分析のサンプルを準備します。。 各サイトで 収集動物消費者単一チューブへの興味の種の個体を整理し、直接液体窒素やドライアイス腸クリアランスと DNA の分解を防ぐためにそれらを凍結します 。 注意: いくつかの動物はアルコールは、それらを殺す前に繰り返す傾向があるのでアルコールでサンプルを保存しないでくだ?…

Representative Results

正常に、このプロトコルの異なる研究内食事分析で説明されている手順を使用しました。このセクションでは、プロトコルのさまざまなセクションの適用を記述する例を示す. 例として、著者28と SSCP 解析による PCR 産物のさらに下流解析の可能性によって確立されたグループ特定のプライマー セットの?…

Discussion

ここでは、簡単かつコスト効率の高い PCR に基づく同じ標本の他の非分子分析と組み合わせることができます rDNA 領域のグループ固有プライマーを介してフィールド サンプルから捕食者-被食者相互作用の決定法を提案する.ただし、プロトコルの中でいくつかの重要な手順があります。まず、使用されるプライマーの特異性を保証することは不可欠です。第二に、それは胃腸管の準備、その?…

Materials

liquid nitrogen	Any	NA	For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory.
1.5 ml reaction tubes – Safelock	Any	NA	For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle.
Stereomicroscope	Any	NA	Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest.
Petri dishes	Any	NA	To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope.
Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7	Bioform	B40d	This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract.
Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5	Bioform	B40b	This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens.
DNA-ExitusPlus	AppliChem	A7409,1000RF	Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations
fuzz-free paper towel	Any	NA
Lab scale	Any	NA	Precision needs to be at least 0.01 g.
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL)	Any	NA
Safe-Lock Tubes 2.0 ml	VWR	211-2165	It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!
Safe-Lock Tubes 1.5 ml	VWR	211-2164	It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!
Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO	carlroth	3957.3	For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA.
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris	carlroth	4855.2	For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL)	carlroth	8043.1	For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer
Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO	carlroth	6943.2	For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained.
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	carlroth	4360.1	For extraction of DNA
Proteinase K lyophil.	carlroth	7528.1	Prepare a working solution containing 10 mg/ml.
TissueLyser II	Quiagen	85300	Bead mill for homogenization of the samples.
Stainless Steel Beads, 5 mm	Quiagen	69989	For homogenization of samples.
Heating Thermoshaker	Any	NA
Vortex Mixer	Any	NA
Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE	Hitachi	NA	Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1).
Isopropanol	carlroth	6752.5
Ethanol 99.8 %, p.a.	Any	NA
Water Molecular biology grade (ddH2O)	AppliChem	A7398,1000	nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript
Unmodified Olegonucleotides	Eurofins MWG Operon	NA	Primers unlabeled
Modified olegonucleotides	Metabion International AG	NA	Primers labelled
peqGOLD Taq all inclusive	VWR Peqlab	01-1000	Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2)
Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient	Peqlab	NA	Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine.
Standard 96 Well PCR Plates	VWR Peqlab	732-2879	Used for PCR reactions.
Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes	VWR Peqlab	732-3223	Cap stripes used to close the PCR plates.
Agarose	Peqlab	35-1020	Used for gel electrophoresis.
Microwave	Any	NA
Conical flask	Any	NA
Measuring cylinder	Any	NA
Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth	Any	NA	For agarose gel electrophoresis.
Electrophoresis Power Supply PS3002	Life Technologies	NA
Ethidium bromide solution 1 %	carlroth	2218.1	Used to prepare staining bath for agarose gels.
Formamide	carlroth	6749.1	Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses.
Bromphenol blue	AppliChem	A3640.0010	Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.
Sucrose	carlroth	4621.1	Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.
100 bp-DNA-Ladder extended	carlroth	T835.1	As size standard for agarose gel electrophoresis.
UV-Documentation system	Any	NA	To visualize gel electrophoresis results.
Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1)	carlroth	A121.1	For the preparation of polyacrylamid gels.
Ammonium peroxydisulphate	carlroth	9592.2	For the preparation of polyacrylamid gels.
foldback clips (32 mm)	Any	NA	For the preparation of polyacrylamid gels.
square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm)	Any	NA	For the preparation of polyacrylamid gels.
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	carlroth	23.67.1	For the preparation of polyacrylamid gels.
Beaker	Any	NA
RC 10 Digital chiller	VWR	462-0138	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems)	VWR	700-2361	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Notched glass plate	VWR	730-0261	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Blank glass plate	VWR	730-0260	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Spacers	VWR	730-0262	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Comb with 25 teeth	VWR	730-0294	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Shaking platform	Any	NA	For constant shaking of the staining bath.
GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.)	Biozym	850535 (50535)	For staining of polyacrylamide gels.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp	AB Sciex	608098	For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp	AB Sciex	608095	For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A.
Sample Loading Solution (SLS)	AB Sciex	608082	For automated fragment analyses.
Sequenzing plate – 96 Well Polypropylene PCR Microplate	Costar	6551	For automated fragment analyses.
Plate centrifuge, PerfectSpin P	VWR Peqlab	NA	mini plate centrifuge used to spin down PCR products.
Buffer plate – 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate	Corning	9017	For automated fragment analyses.
GenomeLab Seperation buffer	AB Sciex	608012	For automated fragment analyses.
Separation Gel – LPAI	AB Sciex	608010	For automated fragment analyses.
Sequenzer – CEQ8000 Genetic Analysis System	Beckman Coulter	NA	For automated fragment analyses.
GeneMarker V1.95	Softgenetics	NA	To analyze results of automated fragment analyses.