Laboratoriet protokoll for genetisk Gut innhold analyser av akvatiske Macroinvertebrates bruke gruppe-spesifikke rDNA primere

Summary

Vanligste gut innhold analyser av macroinvertebrates er visuelle. Krever intens kunnskap om morfologiske mangfold av byttedyr organismer, de savner myk bodied byttedyr og på grunn av sterk comminution av byttedyr, er nesten umulig for noen organismer, inkludert amfipoder. Vi gir detaljert, romanen genetiske metoder for macroinvertebrate byttedyr identifikasjon i kostholdet av amfipoder.

Abstract

Analysere næringskjeder er avgjørende for en bedre forståelse av økosystemene. For eksempel kan næringskjeden interaksjoner gjennomgå alvorlige endringer forårsaket av invasjonen av ikke-stedegne arter. Men er en nøyaktig identifikasjon av feltet predator-byttedyr interaksjoner vanskelig i mange tilfeller. Disse analysene er ofte basert på en visuell vurdering av tarmen innhold eller analyse av stabil isotop prosenter (ses¹⁵N og ses¹³C). Slike metoder krever omfattende kunnskap om, henholdsvis morfologiske mangfold eller isotopanrikning signatur fra personlige byttedyr organismer, fører til hindringer i nøyaktig identifikasjon av byttedyr organismer. Visuelle gut innhold analyser undervurdere spesielt myk bodied byttedyr organismer, fordi maserasjon, fordøyelse og fordøyelse av byttedyr gjøre identifikasjon av spesifikk arter vanskelig. Derfor polymerase kjedereaksjon (PCR) basert strategier, for eksempel bruk av gruppespesifikke primer sett, gir et kraftig verktøy for etterforskningen av næringskjeden interaksjoner. Her beskriver vi detaljerte protokoller for å undersøke gut innholdet macroinvertebrate forbrukere fra feltet bruker gruppespesifikke primer sett for kjernefysisk ribosomal deoksyribonukleinsyre (rDNA). DNA kan være Hentet fra hele eksemplarer (i tilfelle av små taxa) eller fra tarmen innholdet av samlet i feltet. Tilstedeværelse og funksjonelle effektivitet DNA malene må bekreftes direkte fra den testede enkelt bruker universell primer sett målretting den respektive delenhet i DNA. Vi viser også at brukte byttedyr kan bestemmes videre til arter nivå via PCR med uforandret gruppespesifikke primere kombinert med påfølgende enkelt tråd konformasjon polymorfisme (SSCP) analyser bruker polyakrylamid gels. Videre viser vi at bruk av ulike fluorescerende fargestoffer som etiketter kan parallelle screening for DNA fragmenter av ulike byttedyr grupper fra flere gut innhold prøver via automatisert fragment analyse.

Introduction

Predator-byttedyr interaksjoner, som utgjør flertallet av trophic interaksjoner og næringskjeden dynamikk, er viktige aspekter å karakterisere flukser av materie og energi gjennom næringskjeder innenfor og mellom økosystemer, som er en av de viktigste målene for økologi ¹. fastsettelse av kilden og flyt av karbon og næringsstoffer er fremme forståelsen av økologiske tilkobling mellom økosystemer². Imidlertid er økosystemer, som elver og deres nedbørfelt, ikke bare koblet av flukser av organisk stoff og næringsstoffer, men også av bevegelser av organismer³. Dermed kan habitat endringer forstyrre flyten av ressurser som kobler disse systemene sterkt endre næringskjeder både økosystemer, ikke bare direkte, men også indirekte ved å endre respektive sammensetningen av predator-byttedyr samfunn. For eksempel vist endringer av næringskjeder seg å være knyttet til bevegelser av enkelt predator arter (f.eks, regnbueørret)⁴. Slike endringer truer potensielt biologisk mangfold og funksjon av akvatiske økosystemer. Analysere predator-byttedyr interaksjoner i feltet er derfor viktig å fastslå effekten av menneskeskapte miljømessige endringer, for eksempel vann forvaltningspraksis på det opprinnelige biodiversitet av akvatiske økosystemer.

Siden sporing trophic sammenhengene er vanskelig i komplekse systemer, har flere tilnærminger blitt etablert som aktiverer vurdering av fôring interaksjoner i feltet⁵. Tradisjonelt undersøkelser av fôring interaksjoner i feltet er basert på visuell identifikasjon av byttedyr i dissekert guts og krever en omfattende kunnskap om morfologiske byttedyr mangfold. Visuelle gut innhold analyser har gitt innsikt i ressursbruk av flere grupper av forbrukerne (f.eks sesongvariasjon i kostholdet i hummer⁶ og fisk^7,8 eller fôring valg av Raudåta). Men fysisk prosessen med fordøyelsen gjør visuelle gut innhold analyser vanskelig og vanligvis bommer myk bodied byttedyr-organismer⁹. Arter fôring av flytende inntak eller noen virvelløse forbrukere som intenst comminute maten før svelging, som amfipoder, er visuell identifikasjon av byttedyr i tarmen innholdet umulig¹⁰. På grunn av disse begrensningene er molekylær analyse et lovende alternativ.

Molekylær analyser har nå blitt et vanlig verktøy tillater rask og presis byttedyr oppdagelsen i tarmen innholdet. Slike teknikker er mangfoldige: strategier basert på monoklonale antistoffer eller polymerase kjedereaksjoner (PCR) blir ofte brukt, på grunn av deres høy spesifisitet og følsomhet¹¹. Utviklingen av nye monoklonale antistoffer er tid – og kostnadskrevende, derfor bruk av andre molekylære teknikker er mer nyttig når antistoffer ikke allerede finnes¹¹. En annen felles tilnærming er forsterkning av regionene i deoksyribonukleinsyre (DNA), som ribosomal ribonukleinsyre (RNA) gener i de fleste arter, bruker universell primer angir^12,13. Når du bruker denne teknikken, er det ofte ikke mulig å identifisere hele spekteret av byttedyr organismer i blandet kilder DNA¹⁴. En effektiv tilnærming til å unngå slik en ulempe er å bruke gruppespesifikke primer sett for genetisk gut innhold analyser. Utviklet for å forsterke bare DNA regioner i bestemte målgrupper og utelukke alle andre arter^15,16, aktiverer gruppespesifikke primere identifisering av byttedyr organismer på taksonomisk nivået på de angitte gruppene uten tid – og kostnadskrevende sekundære analyser. Men som alle gut innholdsanalyse, gi slike analyser bare et øyeblikksbilde av fôring atferd. Derfor regnes kombinere molekylær gut innhold analyser med analyser av tid-integrere naturlig tracers (f.eks isotoper) gunstig^1,2.

Her beskriver vi en detaljert metode for PCR-baserte undersøkelser av predator-byttedyr interaksjoner ved hjelp av gruppespesifikke primer sett for kjernefysisk ribosomal DNA (rDNA) regioner kombineres med stabil isotop analyser av samme prøven. Vi beskriver oppdagelsen av DNA av enkelt bytte grupper via agarose gel geleelektroforese. I tillegg presenterer vi en mulighet for videre nedstrøms analyser av PCR produkter av slike gruppespesifikke primere gjelder når en høyere taksonomisk oppløsning enn primerne spesifisitet er nødvendig. Fordi enkelt strandet DNA (ssDNA) fragmenter skjemaet tertiær konformasjonen som bestemmes av deres primære sekvens¹⁷, føre små variasjoner i fragmenter forsterket av slike gruppespesifikke primere til conformational endringer. Slike endringer kan oppdages ved enkelt tråd konformasjon polymorfisme (SSCP) analyser med polyakrylamid gels^17,18, muliggjør en mer nøyaktig identifikasjon av byttedyr organismer (ned til arter nivå).

Mens agarose gel geleelektroforese er en vanlig og rimelig verktøy for å visualisere DNA fragmenter og bestemme deres omtrentlig lengde¹⁹, oppløsningen avhenger av mengden av DNA, og flekker fargestoff brukt²⁰. Vanligvis visualisering er rett frem når du arbeider med ren DNA-prøver, men potensielt lave mengder byttedyr DNA i tarmen innholdet forbrukere kan komplisere scoring av agarose gel geleelektroforese resultater. Likevel denne oppdagelsen metoden er mulig å skjermen et lavt antall forbruker prøver fra feltet en eller noen byttedyr grupper, men komplikasjon i scoring gjør screening av et høyt antall prøver i flere byttedyr taxa tid svært intensiv og dermed upraktisk. En mer følsomme gjenkjennings-metoden er automatisk analyse av fragmenter via kapillært geleelektroforese, som i tillegg lar fastsettelse av den nøyaktige lengden fragmenter²¹. Flere mikrosatellittmarkør basert studier har vist at ved å bruke ulike fluorescerende fargestoffer som etiketter, er det mulig å oppdage og finne ulike fragmenter av sammenlignbare lengde ved automatisert fragment analyse^{22,23, 24}. Derfor presentere vi også en detaljert protokoll for parallell oppdagelsen av DNA fra flere byttedyr grupper bruker PCR med merket gruppespesifikke primer sett og gjenkjenning via automatisert fragment analyse med en automatisert sequencer. I tillegg presenterer vi resultatene fra en studie viser at påvisning av byttedyr DNA via automatisert fragment analyse er en tilnærming som en relativ kvantifisering av inntatt byttedyr.

Protocol

1. samle Macroinvertebrates fra feltet og forberede prøvene genetisk Gut innhold analyser. Samle macroinvertebrates på hvert område, sortere ut individer av forbrukernes interesse i enkelt rør, og direkte fryse dem i flytende nitrogen eller tørris å hindre gut klarering og nedbrytning av DNA. Merk: Unngå å lagre prøver alkohol, fordi noen macroinvertebrates pleier å regurgitate før alkohol dreper dem. Bare bruke mage-tarmkanalen av mellomstore og store (ca > 3 mm) macroi…

Representative Results

Vi brukt trinnene som beskrives i denne protokollen for diett analyser i forskjellige studier. I denne delen presenterer vi eksempler som beskriver anvendelse av de forskjellige delene av protokollen. Som et eksempel for å demonstrere effektiviteten av gruppespesifikke primer sett av forfattere28 og potensialet for videre nedstrøms analyser av PCR produkter av SSCP analyser, ble en fôring eksperimentet…

Discussion

Her presenterer vi en enkel og kostnadseffektiv metode for PCR-baserte fastsettelse av predator-byttedyr interaksjoner fra feltet prøver via gruppespesifikke primere for rDNA regioner, som kan kombineres med andre ikke-molekylær analyser av de samme. Det er imidlertid flere avgjørende skritt i protokollen. Først er det viktig å sikre spesifisiteten av primere brukt. Dernest er det avgjørende å unngå forurensning og tap av tarmen innholdet materiale under utarbeidelsen av mage-tarmkanalen og påfølgende utvinning…

Materials

liquid nitrogen	Any	NA	For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory.
1.5 ml reaction tubes – Safelock	Any	NA	For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle.
Stereomicroscope	Any	NA	Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest.
Petri dishes	Any	NA	To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope.
Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7	Bioform	B40d	This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract.
Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5	Bioform	B40b	This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens.
DNA-ExitusPlus	AppliChem	A7409,1000RF	Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations
fuzz-free paper towel	Any	NA
Lab scale	Any	NA	Precision needs to be at least 0.01 g.
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL)	Any	NA
Safe-Lock Tubes 2.0 ml	VWR	211-2165	It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!
Safe-Lock Tubes 1.5 ml	VWR	211-2164	It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!
Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO	carlroth	3957.3	For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA.
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris	carlroth	4855.2	For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL)	carlroth	8043.1	For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer
Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO	carlroth	6943.2	For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained.
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	carlroth	4360.1	For extraction of DNA
Proteinase K lyophil.	carlroth	7528.1	Prepare a working solution containing 10 mg/ml.
TissueLyser II	Quiagen	85300	Bead mill for homogenization of the samples.
Stainless Steel Beads, 5 mm	Quiagen	69989	For homogenization of samples.
Heating Thermoshaker	Any	NA
Vortex Mixer	Any	NA
Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE	Hitachi	NA	Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1).
Isopropanol	carlroth	6752.5
Ethanol 99.8 %, p.a.	Any	NA
Water Molecular biology grade (ddH2O)	AppliChem	A7398,1000	nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript
Unmodified Olegonucleotides	Eurofins MWG Operon	NA	Primers unlabeled
Modified olegonucleotides	Metabion International AG	NA	Primers labelled
peqGOLD Taq all inclusive	VWR Peqlab	01-1000	Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2)
Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient	Peqlab	NA	Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine.
Standard 96 Well PCR Plates	VWR Peqlab	732-2879	Used for PCR reactions.
Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes	VWR Peqlab	732-3223	Cap stripes used to close the PCR plates.
Agarose	Peqlab	35-1020	Used for gel electrophoresis.
Microwave	Any	NA
Conical flask	Any	NA
Measuring cylinder	Any	NA
Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth	Any	NA	For agarose gel electrophoresis.
Electrophoresis Power Supply PS3002	Life Technologies	NA
Ethidium bromide solution 1 %	carlroth	2218.1	Used to prepare staining bath for agarose gels.
Formamide	carlroth	6749.1	Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses.
Bromphenol blue	AppliChem	A3640.0010	Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.
Sucrose	carlroth	4621.1	Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.
100 bp-DNA-Ladder extended	carlroth	T835.1	As size standard for agarose gel electrophoresis.
UV-Documentation system	Any	NA	To visualize gel electrophoresis results.
Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1)	carlroth	A121.1	For the preparation of polyacrylamid gels.
Ammonium peroxydisulphate	carlroth	9592.2	For the preparation of polyacrylamid gels.
foldback clips (32 mm)	Any	NA	For the preparation of polyacrylamid gels.
square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm)	Any	NA	For the preparation of polyacrylamid gels.
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	carlroth	23.67.1	For the preparation of polyacrylamid gels.
Beaker	Any	NA
RC 10 Digital chiller	VWR	462-0138	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems)	VWR	700-2361	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Notched glass plate	VWR	730-0261	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Blank glass plate	VWR	730-0260	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Spacers	VWR	730-0262	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Comb with 25 teeth	VWR	730-0294	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Shaking platform	Any	NA	For constant shaking of the staining bath.
GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.)	Biozym	850535 (50535)	For staining of polyacrylamide gels.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp	AB Sciex	608098	For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp	AB Sciex	608095	For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A.
Sample Loading Solution (SLS)	AB Sciex	608082	For automated fragment analyses.
Sequenzing plate – 96 Well Polypropylene PCR Microplate	Costar	6551	For automated fragment analyses.
Plate centrifuge, PerfectSpin P	VWR Peqlab	NA	mini plate centrifuge used to spin down PCR products.
Buffer plate – 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate	Corning	9017	For automated fragment analyses.
GenomeLab Seperation buffer	AB Sciex	608012	For automated fragment analyses.
Separation Gel – LPAI	AB Sciex	608010	For automated fragment analyses.
Sequenzer – CEQ8000 Genetic Analysis System	Beckman Coulter	NA	For automated fragment analyses.
GeneMarker V1.95	Softgenetics	NA	To analyze results of automated fragment analyses.