Summary

Protocole de laboratoire pour les Analyses de contenu Gut génétiques de macroinvertébrés aquatiques Using Group-specific ADNr amorces

Published: October 05, 2017
doi:

Summary

Plus courantes analyse de contenu des contenus stomacaux des macroinvertébrés sont visuels. Exigeant la connaissance intense sur la diversité morphologique des proies, ils manquer doux corsé proies et, en raison de la forte fragmentation des proies, sont presque impossibles pour certains organismes, y compris les amphipodes. Nous fournissons des approches génétiques détaillées, roman de macroinvertébrés proie d’identification dans le régime alimentaire des amphipodes.

Abstract

Analyse de la chaîne alimentaire est essentiel pour une meilleure compréhension des écosystèmes. Par exemple, trophiques peuvent subir des modifications graves provoquées par l’invasion d’espèces allogènes. Cependant, une identification exacte des interactions prédateur-proie de champ est difficile dans de nombreux cas. Ces analyses sont souvent basées sur une évaluation visuelle du contenu intestinal ou l’analyse des ratios d’isotopes stables (δ15N et δ13C). Ces méthodes nécessitent une connaissance approfondie concernant, respectivement, la diversité morphologique ou signature isotopique des organismes individuels proies, conduisant à des obstacles à l’identification exacte des proies. Analyse de contenu des contenus stomacaux Visual sous-estiment particulièrement doux corsé proies organismes, car macération, ingestion et la digestion des proies compliquent l’identification d’espèces spécifiques. Par conséquent, l’utilisation des amorces spécifiques à un groupe définit des stratégies de réaction en chaîne (PCR) basée de polymérase, par exemple, fournissent un outil puissant pour l’étude des interactions de réseau trophique. Nous décrivons ici les protocoles détaillés afin d’examiner le contenu stomacal de consommateurs de macroinvertébrés du champ à l’aide d’amorces spécifiques à un groupe pour l’acide désoxyribonucléique ribosomal nucléaire (ADNr). L’ADN peut être extraits soit à partir des spécimens entiers (dans le cas des petits taxons) ou de contenus stomacaux de spécimens recueillis sur le terrain. Présence et efficacité fonctionnelle des modèles ADN doivent être confirmés directement à partir de l’individu testé avec l’amorce universelle définit ciblant la sous-unité respectif de l’ADN. Nous démontrons également que des proies consommées peuvent être déterminée en combiné supplémentaire jusqu’au niveau de l’espèce par PCR avec des amorces spécifiques à un groupe non modifiées avec analyses de polymorphisme (SSCP) de conformation monocaténaires ultérieure à l’aide de gels de polyacrylamide. De plus, nous montrons que l’utilisation de différents colorants fluorescents sous forme d’étiquettes permet de projection parallèle pour les fragments d’ADN de proies différentes groupes de plusieurs échantillons de contenu intestin par l’intermédiaire de l’analyse des fragments automatisés.

Introduction

Interactions prédateur-proie, qui constituent la majorité des interactions trophiques et dynamique du réseau trophique, sont des aspects essentiels pour caractériser les flux de matière et d’énergie tout au long de la chaîne alimentaire au sein et entre les écosystèmes, qui est l’un des principaux objectifs de l’écologie 1. la détermination de la source et flux de carbone et des nutriments sont faire avancer la compréhension de la connectivité écologique entre les écosystèmes2. Cependant, les écosystèmes, comme les rivières et leurs bassins versants, ne sont pas seulement liées par les flux de matière organique et des nutriments mais aussi par les mouvements des organismes3. Ainsi, modifications de l’habitat interrompre le flux des ressources qui relient ces systèmes peuvent fortement modifier les réseaux trophiques des deux écosystèmes, non seulement directement mais aussi indirectement en changeant la composition respective des communautés de prédateur-proie. Par exemple, modification des réseaux trophiques ont démontré être lié aux mouvements du prédateur unique espèce (p. ex., la truite arc-en-ciel)4. Ces changements éventuellement mettre en danger la biodiversité et le fonctionnement des écosystèmes aquatiques. Analyse des interactions prédateur-proie dans le domaine est donc essentiel de déterminer l’impact des changements environnementaux induite par l’homme, tels que les pratiques de gestion de l’eau, la biodiversité autochtone des écosystèmes aquatiques.

Suivi des liens trophiques étant difficile dans des systèmes complexes, plusieurs approches ont été établis qui permettent l’évaluation de l’alimentation des interactions dans le champ5. Traditionnellement, enquêtes sur les interactions dans le domaine de l’alimentation reposent sur l’identification visuelle des restes de proies dans les tripes disséqués et nécessitent une connaissance approfondie de la diversité morphologique de proies. Analyses de contenu visuel gut ont fourni des perspicacités dans l’utilisation des ressources de plusieurs groupes de consommateurs (p. ex. variation saisonnière dans le régime alimentaire de homard6 poissons7,8 ou alimentation de préférences et de copépodes). Cependant, le processus physique de digestion complique l’analyse de contenu des contenus stomacaux visuelle et ne manque généralement doux corsé proies-organismes9. Pour les espèces l’alimentation par l’ingestion de liquide ou pour certains consommateurs d’invertébrés qui pulvérisent intensivement leur nourriture avant l’ingestion, comme les amphipodes, identification visuelle des proies dans le contenu intestinal est impossible10. En raison de ces limitations, l’analyse moléculaire offre une alternative prometteuse.

Des analyses moléculaires sont devenus un outil commun permettant la détection de proies rapides et précises dans le contenu intestinal. La gamme de ces techniques est diversifiée : des stratégies fondées sur des anticorps monoclonaux ou des réactions en chaîne par polymérase (PCR) sont souvent utilisés, en raison de leur spécificité et sensibilité élevée11. Le développement de nouveaux anticorps monoclonaux est beaucoup de temps et de coût, par conséquent, l’application des autres techniques moléculaires est plus utile lorsque des anticorps n’existent pas déjà11. Une autre approche commune est l’amplification des régions de l’acide désoxyribonucléique (ADN), comme l’acide ribonucléique ribosomique (ARN) gènes présents dans la plupart des espèces, à l’aide de l’amorce universelle définit12,13. Lorsque vous utilisez cette technique, il n’est souvent pas possible d’identifier l’ensemble des organismes de proies dans les sources mixtes d’ADN14. Une approche efficace pour éviter un tel inconvénient, c’est d’utiliser des amorces spécifiques à un groupe définit pour l’analyse de contenu des contenus stomacaux génétique. Conçu pour amplifier les seules régions de l’ADN de certains groupes cibles et exclure toutes les autres espèces15,16, amorces spécifiques de groupe permettent d’identifier des proies organismes sur le plan taxonomique des groupes spécifiés sans analyses secondaires de gourmandes en temps et en coût. Cependant, comme tout vider l’analyse du contenu, de telles analyses fournissent seulement un instantané du comportement alimentaire. Par conséquent, combinant l’analyse de contenu des contenus stomacaux moléculaires avec les analyses des temps-intégration des traceurs naturels (p. ex., les isotopes stables) est considérée comme bénéfique1,2.

Nous décrivons ici une méthode détaillée pour les études basées sur la PCR des interactions prédateurs-proies à l’aide d’amorces spécifiques à un groupe de régions de l’ADN (ADNr) ribosomales nucléaires pour être combinés avec les analyses des isotopes stables du même spécimen. Nous décrivons la détection de l’ADN de proies unique par électrophorèse sur gel d’agarose. En outre, nous présentons une opportunité pour approfondir les analyses en aval des produits PCR de ces amorces de groupe spécifiques applicables lorsqu’une résolution taxonomique supérieure à la spécificité des amorces est requise. Étant donné que seul ADN bicaténaire (ssDNA) des fragments des conformations tertiaire forme qui dépendent de leur séquence primaire17, en fragments amplifiés par des amorces spécifiques à un groupe de petites variations mener aux changements conformationnels. Ces changements peuvent être détectées par single strand conformation polymorphisme (SSCP) analyses avec des gels de polyacrylamide17,18, ce qui permet une identification plus précise des organismes de proies (jusqu’au niveau de l’espèce).

Alors que le gel d’agarose est un outil commun et peu coûteux pour visualiser les fragments d’ADN et déterminer leur durée approximative19, la résolution dépend de la quantité d’ADN et la teinture coloration utilisé20. Habituellement, la visualisation est simple lorsque vous travaillez avec des échantillons d’ADN purs, mais éventuellement de faibles quantités de proies ADN dans le contenu stomacal de consommateurs peut compliquer l’évaluation des résultats de l’électrophorèse sur gel d’agarose. Pourtant, cette méthode de détection est faisable pour dépister un faible nombre de spécimens de consommateurs sur le terrain un ou quelques groupes de proies, mais complication dans la notation rend la projection d’un grand nombre d’échantillons pour plusieurs taxons de proie fois extrêmement intensif et donc impraticable. Une méthode de détection plus sensible est l’analyse automatique de fragments par électrophorèse capillaire, ce qui permet en outre de la détermination de la longueur exacte des fragments21. Plusieurs microsatellites basé ont démontré qu’en utilisant différents colorants fluorescents sous forme d’étiquettes, il est possible de détecter et de déterminer les différents fragments de longueur comparable par fragment automatisés analyse22,23, 24. Par conséquent, nous présentons également un protocole détaillé pour détection parallèle de l’ADN de la proie de plusieurs groupes par PCR avec des amorces spécifiques à un groupe étiquetées et détection par analyse des fragments automatisés avec un séquenceur automatique. En outre, nous présentons les résultats d’une étude de cas qui démontre que la détection de l’ADN de proies par l’intermédiaire de l’analyse des fragments automatisés est une approche qui permet également une quantification relative des proies ingérées.

Protocol

1. collecter les macroinvertébrés du champ et préparer les échantillons pour les Analyses de contenu génétique Gut. Collect macroinvertébrés sur chaque site, trier les individus des espèces de consommateur d’intérêt dans les tubes simples et congeler directement dans l’azote liquide ou de neige carbonique pour empêcher le dégagement de l’intestin et la dégradation de l’ADN. Remarque : Éviter de stocker les échantillons dans l’alcool, car certains macroinvertébrés ont tendanc…

Representative Results

Nous avons utilisé avec succès les étapes décrites dans le présent protocole pour l’analyse de la diète dans les différentes études. Dans cette section, nous présentons des exemples décrivant l’applicabilité des différentes sections du protocole. À titre d’exemple, pour démontrer l’efficacité des amorces spécifiques à un groupe créé par les auteurs28 et la possibilité d’appro…

Discussion

Nous présentons ici une méthode simple et rentable pour PCR-based détermination des interactions prédateur-proie des échantillons sur le terrain via des amorces spécifiques à un groupe pour les régions d’ADNr, qui peuvent être combinées avec d’autres analyses non moléculaire des échantillons mêmes. Cependant, il y a plusieurs étapes cruciales au sein du protocole. Tout d’abord, il est essentiel d’assurer la spécificité des amorces utilisées. Deuxièmement, il est essentiel d’éviter la contamin…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Silke Classen de l’Institut de recherche pour l’analyse de l’écosystème et évaluation (gaiac), RWTH Aachen pour son aide dans la mise en place des amorces spécifiques utilisés dans le présent protocole. Nous remercions également Peter Martin et Laura Schynawa de l’Université de Kiel pour la coopération dans les expériences des acariens de l’eau. Nous remercions également les assistants de laboratoire technique pour garder le laboratoire fonctionne bien et préparer le registre des sociétés et des numéros de catalogue. Ce travail a été soutenu par la Fondation de recherche allemande (DFG ; projet GE 2219/3-1).

Materials

liquid nitrogen Any NA For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory.
1.5 ml reaction tubes – Safelock Any NA For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle.
Stereomicroscope Any NA Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest.
Petri dishes Any NA To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope.
Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7 Bioform B40d This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract.
Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5 Bioform B40b This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens.
DNA-ExitusPlus AppliChem A7409,1000RF Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations
fuzz-free paper towel Any NA
Lab scale Any NA Precision needs to be at least 0.01 g.
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) Any NA
Safe-Lock Tubes 2.0 ml VWR 211-2165 It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!
Safe-Lock Tubes 1.5 ml VWR 211-2164 It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!
Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO carlroth 3957.3 For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA.
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris carlroth 4855.2 For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL) carlroth 8043.1 For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer
Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO carlroth 6943.2 For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained.
Sodium dodecyl sulfate (SDS) carlroth 4360.1 For extraction of DNA
Proteinase K lyophil. carlroth 7528.1 Prepare a working solution containing 10 mg/ml.
TissueLyser II Quiagen 85300 Bead mill for homogenization of the samples.
Stainless Steel Beads, 5 mm Quiagen 69989 For homogenization of samples.
Heating Thermoshaker Any NA
Vortex Mixer Any NA
Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE Hitachi NA Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1).
Isopropanol carlroth 6752.5
Ethanol 99.8 %, p.a. Any NA
Water Molecular biology grade (ddH2O) AppliChem A7398,1000 nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript
Unmodified Olegonucleotides Eurofins MWG Operon NA Primers unlabeled
Modified olegonucleotides Metabion International AG NA Primers labelled
peqGOLD Taq all inclusive VWR Peqlab 01-1000 Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2)
Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient Peqlab NA Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine.
Standard 96 Well PCR Plates VWR Peqlab 732-2879 Used for PCR reactions.
Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes VWR Peqlab 732-3223 Cap stripes used to close the PCR plates.
Agarose Peqlab 35-1020 Used for gel electrophoresis.
Microwave Any NA
Conical flask Any NA
Measuring cylinder Any NA
Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth Any NA For agarose gel electrophoresis.
Electrophoresis Power Supply PS3002 Life Technologies NA
Ethidium bromide solution 1 % carlroth 2218.1 Used to prepare staining bath for agarose gels.
Formamide carlroth 6749.1 Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses.
Bromphenol blue AppliChem A3640.0010 Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.
Sucrose carlroth 4621.1 Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.
100 bp-DNA-Ladder extended carlroth T835.1 As size standard for agarose gel electrophoresis.
UV-Documentation system Any NA To visualize gel electrophoresis results.
Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1) carlroth A121.1 For the preparation of polyacrylamid gels.
Ammonium peroxydisulphate carlroth 9592.2 For the preparation of polyacrylamid gels.
foldback clips (32 mm) Any NA For the preparation of polyacrylamid gels.
square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm) Any NA For the preparation of polyacrylamid gels.
Tetramethylethylenediamine (TEMED) carlroth 23.67.1 For the preparation of polyacrylamid gels.
Beaker Any NA
RC 10 Digital chiller VWR 462-0138 For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems) VWR 700-2361 For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Notched glass plate VWR 730-0261 For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Blank glass plate VWR 730-0260 For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Spacers VWR 730-0262 For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Comb with 25 teeth VWR 730-0294 For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Shaking platform Any NA For constant shaking of the staining bath.
GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.) Biozym 850535 (50535) For staining of polyacrylamide gels.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp AB Sciex 608098 For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp AB Sciex 608095 For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A.
Sample Loading Solution (SLS) AB Sciex 608082 For automated fragment analyses.
Sequenzing plate – 96 Well Polypropylene PCR Microplate Costar 6551 For automated fragment analyses.
Plate centrifuge, PerfectSpin P VWR Peqlab NA mini plate centrifuge used to spin down PCR products.
Buffer plate – 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate Corning 9017 For automated fragment analyses.
GenomeLab Seperation buffer AB Sciex 608012 For automated fragment analyses.
Separation Gel – LPAI AB Sciex 608010 For automated fragment analyses.
Sequenzer – CEQ8000 Genetic Analysis System Beckman Coulter NA For automated fragment analyses.
GeneMarker V1.95 Softgenetics NA To analyze results of automated fragment analyses.

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Citer Cet Article
Koester, M., Gergs, R. Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers. J. Vis. Exp. (128), e56132, doi:10.3791/56132 (2017).

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