Summary

قياس التغيرات في فيفو في خارج الخلية العصبية أثناء الطبع مكافأة السلوكيات في أنثى الهامستر السوري

Published: September 12, 2017
doi:

Summary

هذه الورقة بالتفصيل استخدام تسجيلات أمبيروميتريك إمكانات ثابتة باستخدام ألياف الكربون أقطاب والتكنولوجيا الانزيمية بيوسينسور لقياس إطلاق الدوبامين وغلوتامات مع عالية الدقة الزمنية خلال السلوك الطبيعي مجزية في الهامستر الأنثى.

Abstract

القدرة على قياس الإفراج العصبي على مقياس زمني سريع يسمح أنماط كبيرة مرتبطة بسلوكيات معينة أو التلاعب؛ أداة قوية في توضيح آليات والدوائر الأساسية. بينما استخدمت تقنية ميكرودياليسيس لعقود لقياس ما يقرب من أي أكثر من الفائدة في الدماغ، يقتصر هذا الأسلوب في الأزمنة. وبدلاً من ذلك، مسح سريعة فولتاميتري دوري كل وقتيا دقيقة وحساسة للغاية؛ ومع ذلك، نظراً لأن هذا الأسلوب صعباً من الناحية التقنية يعتمد على اليكترواكتيفيتي لأكثر الفائدة، هو القضاء على احتمال للكشف عن المواد نونيليكترواكتيفي (مثلاً، غلوتامات العصبي). هذه الورقة تفاصيل استخدام نظام تسليم المفتاح الذي يجمع بين الإمكانات الثابتة أمبيروميتري وبيوسينسينج الانزيمية لقياس العصبية اليكترواكتيفي ونونيليكترواكتيفي مع الدقة الزمنية. الاقتران من هذه التقنيات القوية هما يسمح بقياس منشط وطوريه كبيرة بسهولة نسبية، ويسمح بتسجيل من العصبية متعددة في وقت واحد. والهدف من هذه المخطوطة لإثبات عملية قياس الدوبامين وغلوتامات كبيرة في فيفو استخدام سلوك الطبيعي مجزية (أي، السلوك الجنسي) في اليرانب الإناث، مع الهدف النهائي المتمثل في عرض الجدوى التقنية لهذا التحليل لدراسة السلوكيات والنماذج التجريبية الأخرى.

Introduction

القدرة على قياس الإفراج العصبي في الحيوانات يتصرف مستيقظا يسمح للباحثين الربط بين سلوكيات معينة مع الأنماط المكانية والزمانية لكبيرة أداة قوية للتحقيق في الآليات والدوائر الأساسية لكلا الطبيعية والسلوك استثابي في الوقت الحقيقي. تاريخيا، استخدمت ميكرودياليسيس لقياس المواد المتفاعلة كهربائياً ونونريكتيفي في الوسط خارج الخلية من الدماغ1. ويستخدم هذا الأسلوب تدفق مستمر من محلول مائي لتكوين الأيونية مماثل للسوائل خارج الخلية، من خلال تحقيق ميكرودياليسيس تتألف من رمح صغير مع تلميح مصنوع من غشاء الألياف المجوفة سيميبيرميابل2. بعد إدراج التحقيق، العصبية أو التحاليل الأخرى التي تهم يمكن عبور الغشاء سيميبيرميابل بنشر السلبي قبل يجري جمعها كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك])، وعلى فترات متقطعة للتحليل اللاحق تقنية الكيمياء التحليلية المستخدمة عادة لفصل، تحديد وقياس المكونات في خليط غير متجانس3.

على الرغم من أن ميكرودياليسيس هو أسلوب حساسة التي يمكن استخدامها لقياس أي تقريبا أكثر من الاهتمام، القرار الزماني منخفضة، مع معدلات أخذ العينات أقصى حدود دقيقة لعشرات الدقائق1،2. يمكن توضيح اختراع مسح سريعة فولتاميتري دوري (فسكف)، أسلوب الذي يعتمد على إمكانيات الأكسدة الأنواع اليكترواكتيفي، قرب لحظية تركيزات أكثر الفائدة في السائل خارج الخلية. باختصار (انظر روبنسون et al. 4 لإجراء استعراض شامل)، يتم تطبيق قطب رفع وخفض الجهد بطريقة موجه ثلاثية في مقياس وقت بسرعة4. عندما يكون الجهد في النطاق الصحيح، مجمع الفائدة مرارا وتكرارا تتأكسد وخفضت. أكسدة والحد من هذه النتائج في حركة الإلكترونات التي تخلق تيار المتردد صغيرة. مسح معدلات تجري بمقياس الفرعية الثانية مع أكسدة والحد من المركبات التي تحدث في ميكرو ثانية. بطرح الخلفية الحالية تم إنشاؤها بواسطة المسبار من الحالية الناجمة عن ذلك، واحد يمكن أن تولد جهد مقابل الأرض الحالية فريدة من نوعها لكل مجمع. حيث يعرف مقياس الوقت للذبذبات الجهد، يمكن استخدام هذه البيانات لحساب قطعة الحالية كدالة للزمن. وهكذا، قد تحددت تركيزات النسبية المجمع طالما نقل عدد الإلكترونات في كل الأكسدة والحد من رد فعل المعروف4.

تجعل هذه الخصائص الكيميائية وعالية الدقة الزمنية فسكف تقنية قوية للكشف عن تغيير تركيزات المواد الكيميائية في الجسم الحي. ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب على الرغم من هذه المزايا المتعددة، الخبرة التقنية الواسعة ومعدات غالية الثمن والإعداد. علاوة على ذلك، لا يمكن قياس العصبية نونيليكترواكتيفي (مثلاً، الغلوتامات) باستخدام هذا الأسلوب. لحسن الحظ، والتقدم التكنولوجي في المجال الكيمياء الكهربائية5، فضلا عن تسويق هذه الاختراعات، أدخلت نهج بسيط نسبيا لقياس العصبية غير اليكترواكتيفي في الحيوانات يتصرف مستيقظا دون المساس بالزمانية الدقة في تقنية تعرف باسم التكنولوجيا الانزيمية بيوسينسور. ويستخدم هذا الأسلوب الانزيمية تحويل العصبي نونيليكترواكتيفي الاهتمام إلى ركائز اثنين، واحد منها هو بيروكسيد الهيدروجين اليكترواكتيفي تم الكشف عنه أكسدة أمبيروميتريك الحالي تولدها بإمكانيات تطبيق5 . (انظر الشكل 1) قياس المسابير biosensor المتاحة تجارياً بطريقة انتقائية تحليلها للفائدة بشكل تنافسي تخفيض مساهمة إينتيرفيرينتس الذاتية. في حالة غلوتامات، المساهمة حمض الأسكوربيك إينتيرفيرينت المشتركة (أإ) تنافسية ينخفض إلى التيار المقاسة بتعريب شارك أوكسيديز AA على سطح الانزيمية النشطة من أجهزة الاستشعار، وتحويل AA لغير اليكترواكتيفي ديهيدرواسكورباتي والماء. وباﻹضافة إلى ذلك، يستبعد بوليمر نافيون مشحونة سلبا على طبقة موجودة تحت الطبقة إنزيم مركبات أنيونى الذاتية.

يمكن قياس هذا الإعداد التجريبية biosensor نفس العصبية اليكترواكتيفي كما هو الحال في فسكف، ولكن بدلاً من ذلك أنها توظف إمكانات إصلاحها تسجيل6. خلافا للجهد تتأرجح المطبقة في فسكف، في تسجيل الثابتة ذات الإمكانات الجهد يتم الاحتفاظ في الأكسدة المحتملة لأكثر الفائدة. على الرغم من أنها أقل كيميائيا انتقائية من فسكف العصبية متعددة قد يؤدي إلى الأكسدة نفس المحتملة، في مناطق الدماغ التي تحرف أغلبية ساحقة نحو ناقل عصبي واحد، طبيعة تسليم المفتاح لهذا النهج ترجح عدم وجود مادة كيميائية خصوصية.

القدرة على قياس الإفراج العصبي اليكترواكتيفي ونونيليكترواكتيفي في قرب الوقت الحقيقي وربطه بأحداث سلوكية معينة توفر فرصة لدراسة التلاقي العصبي الإفراج. هذه المخطوطة تفاصيل استخدام هذا النظام استجواب كبيرة الدوبامين وغلوتامات ردا على مكافأة الطبيعية في الهامستر يتصرف مستيقظا. الهدف من هذه الورقة أن التفاصيل العملية لقياس هذا الإصدار العصبي أثناء السلوك الجنسي في اليرانب الإناث، بهدف إثبات جدواه في دراسة السلوكيات والنماذج التجريبية الأخرى.

قداد نموذجا مثاليا للاستخدام في تسجيلات الكهروكيميائية
تاريخيا، استخدمت نماذج الجرذان والفئران في دراسة السلوك الجنسي. هذه أنواع القوارض الدخول في تسلسل copulatory ديناميكية، التي تنطوي على السلوكيات التماس الإناث العديدة التي تشمل التنقل والاندفاع، والإذن التلوي لجذب الذكور مطاردة وجبل الإناث7في نهاية المطاف. المتصاعدة من الذكور (مع أو بدون الإيلاج المهبلي) تستغرق بضع ثوان فقط، خلالها يمارس الأنثى لها السلوك الجنسي الموقف (يطلق عليها قعس) أيضا إلا لبضع ثوان قبل استئناف سلوكيات التماس النشط. وهذا النمط من السلوك، ويتألف من مستويات عالية من النشاط تتخللها فترات قصيرة من الجمود، إشكالية بالنسبة لقياس كبيرة في سلوك الحيوانات. أولاً، يمكن أن تكون هناك حركة القطع الأثرية في التسجيلات أمبيروميتريك التي لا علاقة لها بالنشاط العصبي. ثانيا، الحركة يرتبط بالإفراج عن العصبية خاصة في بعض مناطق الدماغ. على سبيل المثال، اقترن إطلاق الدوبامين إلى النشاط الحركي في المخطط الظهرية والبطني8،9، استنتاجا بأن تشكل الأساس لقياسات ميكرودياليسيس الدوبامين بعد بسيتشوستيمولانت 10من الإدارة. لأن سلوك التماس أنثى نموذجية في موسt القوارض تنطوي على مستويات عالية من النشاط الحركي، وهي ممثلة بالجزء الأكبر من اختبار السلوك الجنسي بعد 10 دقائق، وهذا يجعل من الصعب تنسب التغيرات في كبيرة على مكونات السلوك الجنسي الصريح بشكل جماعي آخر فقط دقيقة.

لتحليل الشخصية الكيميائية العصبية للسلوك الجنسي للإناث، سعى هذا المعمل من أنواع التي يوجد الحد الأدنى من النشاط الحركي المصاحبة للسلوك الجنسي. تسلسل كوبولاتوري في الهامستر السوري (Mesocricetus الذهبي) مثالي للتسجيلات الكيميائية العصبية نظراً لعدم وجود سلوكيات التماس عادة ما ينظر في الجرذان والفئران11. نتيجة لذلك، سيدخل اليرانب الإناث والحفاظ على الموقف قعس لما يزيد عن 9 دقائق من أصل 10 دقائق اختبار الدورة12. مع عدم وجود حركات الحركي دخيلة الإناث، في فيفو يمكن الحصول على التسجيلات الكهروكيميائية التي يمكن أن ترتبط بمكونات تفاعلات الجنسية مع الذكور.

نوبات copulatory في الهامستر
بعد إدخال حيوان التحفيز الذكور في قاعة الاختبار، سيعكف الذكور في البداية في التحقيق (منظمة العفو الدولية) من الناحية الشرجية التناسلية للإناث قبل تركيب لها (الشكل 2أ). وللذكور جبل، يجب أن تحمل الأنثى تقبلا موقف جنسي المعروف باسم قعس، التي قالت أنها الأقواس ظهرها وينحرف لها ذيل حيث أن الذكور المتصاعدة يمكن الوصول القضيب إلى مهبلها. سيتم تحميل الأنثى، قبض لها هيندقوارتيرس مع كل الكفوف (الشكل 2ب)، الذكور وتبدأ الجه في محاولة للحصول على القضيب الولوج (الشكل 2ج). الذكور سوف جبل الأنثى (دون الإدراج)، فضلا عن إينتروميت لعدد من المرات قبل أن تحقق في نهاية المطاف القذف. ويطلق على هذا التسلسل يتصاعد وإينتروميشنس مما يؤدي إلى القذف نوبة “كوبولاتوري”. وسيكون الذكور عدة نوبات copulatory ضمن جلسة عمل واحدة.

Protocol

وافق على “رعاية الحيوان المؤسسية” واستخدام اللجنة (إياكوك) من “جامعة مينيسوتا” جميع الإجراءات الموصوفة هنا، ووفقا “دليل” لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية 13 . 1-الحيوانات وجراحة كانوليشن السورية الحصول على الهامستر من مورد حيوانات شائعة في حوالي 55 يوما …

Representative Results

استخدام الكهروكيميائية والسلوكية الترميز المنهجية المبينة أعلاه، بدأ هذا المعمل لتوصيف منشط وتقلبات طورية في الدوبامين وغلوتامات خلال في فيفو تسجيلات للسلوك الجنسي. بسبب طريقة دقيقة وقتيا لهذه المنهجية، ونحن أكثر دقة تميز كبيرة خلال السلوك الجنسي؛ وكذلك تنسب تغي…

Discussion

على الرغم من معقدة نسبيا، يمكن أن تنشأ بعض المشاكل عند استخدام هذا الأسلوب. أولاً، يجب أن يكون موضع ستيريوتاكسيك التحقيقات دقيقة: خلافا ميكرودياليسيس أن عينات قطرها أوسع من الوسط خارج الخلية المحيطة بالمسبار، هذا الأسلوب يسمح فقط بقياس العصبي التي تأتي في اتصال مباشر مع التحقيق. ثانيا، ف?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

المؤلف يود أن يشكر الجامعية بوتشير أليكس لمساعدته في تشغيل التجارب السلوكية والجامعية دانيال كروس لمساعدته بتشغيل التعليمة البرمجية Matlab. يدعم هذا المشروع NSF دائرة الرقابة الداخلية 1256799 إلى R.L.M.، والمعهد الوطني “تعاطي المخدرات” من “معاهد الصحة الوطنية في” إطار جائزة رقم T32DA007234.

Materials

Nembutal Oak Pharmaceuticals Inc. 76478-501-50 Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5mg/100g body weight, injected intraperotineally. 
Loxicom analgesic  Norbrook Laboratories  6451603670 NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam. 
Enroflox antibiotic  Norbrook Laboratories  5552915411 Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin.
Beuthanasia-D  Merck Animal Health 00061047305 Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent.
Bone screws Pinnacle Technologies, Inc. 8111-16 1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull. 
Dental acrylic (Bosworth Duz-All) Bosworth  166261C  Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull.
Hardware biosensor setup  Pinnacle Technologies, Inc. 8400-K2 Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system
Base video computer package Pinnacle Technologies, Inc. 9000-K1 The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables. 
Video EQ700 EverFocus camera  package Pinnacle Technologies, Inc.  9000-K10  EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available. 
Sirenia Acquisition software Pinnacle Technologies, Inc. Free–available to download from pinnaclet.com Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review.
Tethered rat in vitro calibration kit Pinnacle Technologies, Inc. 7000-K2-T-BAS  In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051). 
Stir plate  Corning 6795-410D Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors.
Water bath capable of closed loop circulation PolyScience 8006A11B PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature. 
Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae Pinnacle Technology, Inc. 7002-CFS Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission.
Ag/AgCl reference electrode Pinnacle Technology, Inc. 7065 Necessary for carbon fiber recordings.
Glutamate biosensors  Pinnacle Technology, Inc. 7001  Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission.
BASi guide cannulae Pinnacle Technologies, Inc. 7030  Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe.
BASi cannula plastic headpiece for rats  Pinnacle Technologies, Inc. 7011  Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat.

References

  1. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , (2009).
  2. Chaurasia, C. S., et al. AAPS-FDA Workshop white paper: Microdialysis principles, application and regulatory perspectives. Pharm Res. 24 (5), 1014-1025 (2007).
  3. Lindsay, S., Kealey, D. . High performance liquid chromatography. , (1987).
  4. Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo. Clin Chem. 49 (10), 1763-1773 (2003).
  5. Hu, Y., Mitchell, K. M., Albahadily, F. N., Michaelis, E. K., Wilson, G. S. Direct measurement of glutamate release in the brain using a dual enzyme-based electrochemical sensor. Brain Res. 659 (1-2), 117-125 (1994).
  6. Agnesi, F., et al. Wireless instantaneous neurotransmitter concentration system-based amperometric detection of dopamine, adenosine, and glutamate for intraoperative neurochemical monitoring. J Neurosurg. 111 (4), 701-711 (2009).
  7. Erksine, M. S. Solicitation behavior in the estrous female rat: A review. Horm Beh. 23 (4), 473-502 (1989).
  8. Weiner, I., Gal, G., Rawlins, J. N., Feldon, J. Differential involvement of the shell and core subterritories of the nucleus accumbens in latent inhibition and amphetamine-induced activity. Behav Brain Res. 81 (1-2), 123-133 (1996).
  9. Heidbreder, C., Feldon, J. Amphetamine-induced neurochemical and locomotor responses are expressed differentially across the anteroposterior axis of the core and shell subterritories of the nucleus accumbens. Synapse. 29 (4), 310-322 (1998).
  10. Pierce, R. C., Kalivas, P. W. Amphetamine produces sensitized increases in locomotion and extracellular dopamine preferentially in the nucleus accumbens shell of rats administered repeated cocaine. J Pharmacol Exp Ther. 275 (2), 1019-1029 (1995).
  11. Pfaff, D. W. . Drive: Molecular and physiological analyses of a simple reproductive behavior. , (1999).
  12. Carter, C. S. Postcopulatory sexual receptivity in the female hamster: The role of the ovary and the adrenal. Horm Behav. 3 (3), 261-265 (1972).
  13. . . Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. , (2011).
  14. Meisel, R. L., Camp, D. M., Robinson, T. B. A microdialysis study of ventral striatal dopamine during sexual behavior in female Syrian hamsters. Beh Brain Res. 55 (2), 151-157 (1993).
  15. . . 4 Channel EEG/EMG/Biosensor Manual V005. , (2012).
  16. Pellis, S. M., Pellis, V. C. Play-fighting differs from serious play fighting in both target of attack and tactics of fighting in the laboratory rats Rattus norvegicus. Aggress Behav. 13 (3), 227-242 (1987).
  17. Pellis, S. M., Pellis, V. C. Differential rates of attack, defense and counterattack during the developmental decrease in play fighting by male and female rats. Dev Psychobiol. 23 (3), 215-231 (1990).
  18. Pellis, S. M., Hastings, E., Shimizu, T., Kamitakahara, H., Komorowska, J., Forgie, M. L., Kolb, B. The effects of orbital frontal cortex damage on the modulation of defensive responses by rats in playful and non-playful social contexts. Behav Neurosci. 120 (1), 72-84 (2006).
  19. Wakabayashi, K. T., Kiyatkin, E. A. Rapid changes in extracellular glutamate induced by natural arousing stimuli and intravenous cocaine in the nucleus accumbens shell and core. J Neurophysiol. 108 (1), 285-299 (2012).
  20. Kapelsohn, K. I. Improved methods for cutting, mounting, and staining tissue for neural histology. Protoc Exch. , (2015).
  21. Siegel, H. I. Chapter 7: Male sexual behavior. The Hamster: Reproduction and Behavior. , (1985).
  22. Day, J. J., Carelli, R. M. The nucleus accumbens and pavlovian reward learning. Neuroscientist. 13 (2), 148-159 (2007).
  23. Meisel, R. L., Mullins, A. J. Sexual experience in female rodents: Cellular mechanisms and functional consequences. Brain Res. 1126 (1), 56-65 (2006).
  24. Meredith, G. E., Pennartz, C. M., Groenewegen, H. J. The cellular framework for chemical signaling in the nucleus accumbens. Prog Brain Res. 99, 3-24 (1993).
  25. Hedges, V. L., Staffend, N. A. Neural mechanisms of reproduction in females as a predisposing factor for drug addiction. Front Neuroendocrinol. 31 (2), 217-231 (2010).
check_url/fr/56135?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Moore, K. M., Himmler, B. T., Teplitzky, B. A., Johnson, M. D., Meisel, R. L. Measuring In Vivo Changes in Extracellular Neurotransmitters During Naturally Rewarding Behaviors in Female Syrian Hamsters. J. Vis. Exp. (127), e56135, doi:10.3791/56135 (2017).

View Video