Vivo में मापने Extracellular न्यूरोट्रांसमीटर में स्वाभाविक रूप से पुरस्कृत व्यवहार के दौरान महिला सीरियाई हंसटर में परिवर्तन
Summary
इस पत्र का उपयोग करें फिक्स्ड क्षमता amperometric रिकॉर्डिंग कार्बन फाइबर इलेक्ट्रोड और एंजाइमी में प्राकृतिक पुरस्कृत व्यवहार के दौरान उच्च लौकिक संकल्प के साथ डोपामाइन और ग्लूटामेट की रिहाई को मापने के लिए प्रौद्योगिकी का उपयोग करने के लिए महिला हंसटर ।
Abstract
एक तेजी से समय पैमाने पर न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई को मापने की क्षमता neurotransmission के पैटर्न विशिष्ट व्यवहार या जोड़तोड़ से जोड़ा जा करने के लिए अनुमति देता है; elucidating अंतर्निहित तंत्र और सर्किट में एक शक्तिशाली उपकरण । जबकि microdialysis की तकनीक दशकों के लिए इस्तेमाल किया गया है मस्तिष्क में रुचि के लगभग किसी भी analyte उपाय, इस तकनीक लौकिक संकल्प में सीमित है । वैकल्पिक रूप से, तेजी से स्कैन चक्रीय voltammetry दोनों अस्थायी सटीक और अत्यंत संवेदनशील है; हालांकि, क्योंकि यह तकनीकी रूप से कठिन विधि ब्याज की analyte के electroactivity पर निर्भर करता है, nonelectroactive पदार्थों का पता लगाने की संभावना (जैसे, न्यूरोट्रांसमीटर ग्लूटामेट) समाप्त हो जाता है । यह कागज एक टर्नकी प्रणाली है कि फिक्स्ड-संभावित amperometry और एंजाइमी संवेदन दोनों electroactive और लौकिक परिशुद्धता के साथ nonelectroactive न्यूरोट्रांसमीटर उपाय को जोड़ती है का उपयोग विवरण । इन दो शक्तिशाली तकनीकों के बाँधना रिश्तेदार आसानी से दोनों टॉनिक और चरणबद्ध neurotransmission की माप के लिए अनुमति देता है, और एक साथ कई न्यूरोट्रांसमीटर की रिकॉर्डिंग परमिट. इस पांडुलिपि का उद्देश्य एक स्वाभाविक रूप से पुरस्कृत व्यवहार का उपयोग vivo में डोपामाइन और ग्लूटामेट neurotransmission को मापने की प्रक्रिया को प्रदर्शित करने के लिए है (यानी, महिला हंसटर में यौन व्यवहार), प्रदर्शित करने के अंतिम लक्ष्य के साथ अंय व्यवहार और प्रायोगिक मानदंड की जांच के लिए इस परख के तकनीकी व्यवहार्यता ।
Introduction
को जगाए व्यवहार पशुओं में न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई को मापने की क्षमता शोधकर्ताओं neurotransmission के स्थानिक और लौकिक पैटर्न के साथ विशिष्ट व्यवहार लिंक करने के लिए अनुमति देता है-तंत्र और सर्किट दोनों अंतर्निहित की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण दोनों प्राकृतिक और वास्तविक समय में व्यवहार अनुकूलन । ऐतिहासिक रूप से, microdialysis मस्तिष्क के extracellular वातावरण में दोनों बिजली प्रतिक्रियाशील और प्रतिक्रियात्मक पदार्थों को मापने के लिए नियोजित किया गया है1। इस तकनीक extracellular द्रव के लिए समान ईओण संरचना का एक जलीय समाधान के एक सतत प्रवाह का उपयोग करता है, एक microdialysis एक semipermeable खोखले फाइबर झिल्ली2से बना टिप के साथ एक छोटी सी शाफ्ट से बना जांच के माध्यम से । जांच, न्यूरोट्रांसमीटर या ब्याज की अन्य analytes के सम्मिलन के बाद उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) द्वारा बाद में विश्लेषण के लिए अंतराल पर एकत्र किया जा रहा से पहले निष्क्रिय प्रसार द्वारा semipermeable झिल्ली को पार कर सकते हैं, एक विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान तकनीक आमतौर पर अलग करने के लिए उपयोग की पहचान, और एक विषम मिश्रण में घटकों को बढ़ाता है3।
हालांकि microdialysis एक संवेदनशील तकनीक है कि वस्तुतः ब्याज की किसी भी analyte उपाय किया जा सकता है, लौकिक संकल्प कम है, मिनट के क्रम पर अधिकतम नमूना दरों के साथ मिनट के दसियों1,2। तेजी से स्कैन चक्रीय voltammetry के आविष्कार (FSCV), एक तकनीक है कि electroactive प्रजातियों की redox क्षमता पर निर्भर करता है, स्पष्ट द्रव में ब्याज की analyte के तात्कालिक सांद्रता के पास extracellular कर सकते हैं । संक्षेप में (देखें रॉबिंसन एट अल । एक व्यापक समीक्षा के लिए 4 ), एक इलेक्ट्रोड बढ़ाने के लिए लागू किया जाता है और एक तेजी से समय स्केल4पर एक त्रिकोणीय तरंग फैशन में वोल्टेज कम. जब वोल्टेज सही रेंज में है, ब्याज की चक्रवृद्धि बार ऑक्सीकरण और कम है । इस ऑक्सीकरण और इलेक्ट्रॉन की एक आंदोलन में कमी परिणाम है कि एक छोटी सी बारी वर्तमान बनाता है । स्कैन दर ऑक्सीकरण और microseconds में होने वाली यौगिकों की कमी के साथ उप दूसरे पैमाने पर जगह ले । परिणामस्वरूप वर्तमान से जांच के द्वारा बनाई गई पृष्ठभूमि वर्तमान घटाकर, एक एक मौजूदा एक यौगिक के लिए अद्वितीय साजिश बनाम एक वोल्टेज उत्पन्न कर सकते हैं. वोल्टेज दोलनों के समय पैमाने पर जाना जाता है के बाद से, इन डेटा समय के एक समारोह के रूप में वर्तमान के एक भूखंड की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रकार, यौगिक के सापेक्ष सांद्रता एक ऑक्सीकरण और कमी प्रतिक्रिया में स्थानांतरित इलेक्ट्रॉनों की संख्या के रूप में लंबे समय के रूप में निर्धारित किया जा सकता है4जाना जाता है ।
इस रासायनिक विशिष्टता और उच्च लौकिक संकल्प FSCV vivo मेंरासायनिक सांद्रता बदलने का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक बनाते हैं । हालांकि, इन कई गुना लाभ के बावजूद, इस तकनीक व्यापक तकनीकी विशेषज्ञता और महंगा उपकरण और सेटअप की आवश्यकता है । इसके अलावा, nonelectroactive न्यूरोट्रांसमीटर (जैसे, ग्लूटामेट) इस तकनीक का उपयोग कर मापा नहीं जा सकता । सौभाग्य से, electrochemistry के क्षेत्र में तकनीकी प्रगति5, साथ ही इन आविष्कारों के व्यावसायीकरण, एक अपेक्षाकृत सरल दृष्टिकोण को मापने के लिए शुरू की है गैर electroactive न्यूरोट्रांसमीटर व्यवहार पशु लौकिक परिशुद्धता समझौता किए बिना-एक तकनीक एंजाइमी के रूप में जाना जाता है । इस तकनीक के दो सब्सट्रेट में ब्याज की nonelectroactive न्यूरोट्रांसमीटर के एंजाइमी रूपांतरण का उपयोग करता है, जिनमें से एक electroactive हाइड्रोजन पेरोक्साइड है कि एक amperometric ऑक्सीकरण वर्तमान एक लागू संभावित द्वारा उत्पन्न के रूप में पाया जाता है5 . व्यावसायिक रूप से उपलब्ध संवेदी जांच ( चित्र 1देखें) अंतर्जात के योगदान को प्रतिस्पर्धी रूप से कम करके रुचि के analytes को चुनिंदा माप देता है । ग्लूटामेट के मामले में, आम दिग्दर्शन ascorbic एसिड (ए. ए.) के योगदान प्रतिस्पर्धात्मक रूप से मापा वर्तमान करने के लिए सक्रिय एंजाइमी सतह संवेदक के पर सह-स्थानीयकृत aa oxidase द्वारा कम है, ए. ए.-electroactive परिवर्तित dihydroascorbate और पानी । इसके अलावा, एक नकारात्मक एंजाइम परत के तहत वर्तमान Nafion बहुलक परत चार्ज अंतर्जात anionic यौगिकों शामिल नहीं है ।
यह वही एक प्रकार का संवेदी प्रयोगात्मक सेटअप FSCV में के रूप में electroactive न्यूरोट्रांसमीटर उपाय कर सकते हैं, लेकिन इसके बजाय यह एक निश्चित-संभावित रिकॉर्डिंग6काम. FSCV में लागू दोलन वोल्टेज के विपरीत, एक निश्चित क्षमता रिकॉर्डिंग में वोल्टेज ब्याज की analyte के लिए redox क्षमता पर रखा जाता है । हालांकि यह कम रासायनिक FSCV की तुलना में चयनात्मक के रूप में कई न्यूरोट्रांसमीटर एक ही redox क्षमता हो सकता है, मस्तिष्क क्षेत्रों में है कि भारी एक न्यूरोट्रांसमीटर की ओर विषम, इस दृष्टिकोण की बारी-प्रमुख प्रकृति रासायनिक की कमी का वजन विशिष्टता.
के पास वास्तविक समय में दोनों electroactive और nonelectroactive न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई को मापने और विशिष्ट व्यवहार की घटनाओं के लिए यह लिंक करने की क्षमता converging न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई की जाँच करने के लिए एक अवसर प्रदान करता है. इस पांडुलिपि विवरण इस प्रणाली के उपयोग के लिए दोनों डोपामाइन और ग्लूटामेट neurotransmission में प्राकृतिक इनाम के जवाब में पूछताछ करने के लिए । इस कागज का उद्देश्य विस्तार करने के लिए महिला हंसटर में यौन व्यवहार के दौरान इस न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई को मापने की प्रक्रिया है, अन्य व्यवहार और प्रायोगिक मानदंड की जांच के लिए अपनी व्यवहार्यता का प्रदर्शन करने के लक्ष्य के साथ.
हंसटर विद्युत रिकॉर्डिंग में उपयोग के लिए एक आदर्श मॉडल है
ऐतिहासिक रूप से, चूहे और चूहों के मॉडल यौन व्यवहार के अध्ययन में नियोजित किया गया है । इन कुतर प्रजातियों एक गतिशील copulatory अनुक्रम में संलग्न, कई महिला याचना व्यवहार शामिल है कि hopping, डार्टिंग, और कान के लिए पीछा करने के लिए पुरुष को लुभाने के लिए और अंत में महिला7माउंट के लिए उतारना । पुरुष द्वारा बढ़ते (के साथ या योनि प्रवेश के बिना) केवल कुछ ही सेकंड रहता है, जिसके दौरान महिला उसे यौन व्यवहार मुद्रा में संलग्न है ( अग्रकुब्जताशब्द) भी केवल कुछ ही सेकंड के लिए सक्रिय कानूनन व्यवहार शुरू करने से पहले । व्यवहार का यह पैटर्न, गतिशीलता की संक्षिप्त अवधि के साथ गतिविधि interspersed के उच्च स्तर से बना, जानवरों बर्ताव में neurotransmission को मापने के लिए समस्याग्रस्त है. सबसे पहले, वहां amperometric रिकॉर्डिंग है कि तंत्रिका गतिविधि के लिए असंबंधित है में आंदोलन कलाकृतियों हो सकता है । दूसरा, गतिवान कुछ मस्तिष्क क्षेत्रों में विशेष न्यूरोट्रांसमीटर की रिहाई के साथ जुड़ा हुआ है. उदाहरण के लिए, डोपामाइन जारी पृष्ठीय और ventral striatum8,9में हरकत गतिविधि को युग्मित किया गया है, एक खोज है कि डोपामाइन निम्नलिखित psychostimulant के microdialysis माप के लिए आधार का गठन प्रशासन10. क्योंकि महिला-राज्यमंत्री में ठेठ याचना व्यवहारt कुतर हरकत गतिविधि के उच्च स्तर शामिल है, और एक 10 मिनट के यौन व्यवहार की परीक्षा के थोक द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं, यह यह कठिन यौन व्यवहार के स्पष्ट घटकों के लिए neurotransmission में परिवर्तन परमशॆवर है कि केवल पिछले मिनट.
महिला यौन व्यवहार के neurochemical प्रोफ़ाइल का विश्लेषण करने के लिए, इस प्रयोगशाला बाहर यौन व्यवहार के साथ कम हरकत गतिविधि है जिसमें एक प्रजाति की मांग की । सीरियाई हंसटर में copulatory अनुक्रम (Mesocricetus auratus) याचना व्यवहार की कमी के कारण आम तौर पर चूहों और चूहों में देखा11neurochemical रिकॉर्डिंग के लिए आदर्श है । एक परिणाम के रूप में, महिला हंसटर में प्रवेश और 9 मिनट के ऊपर के लिए अग्रकुब्जता मुद्रा बनाए रखने के एक 10 मिनट के परीक्षण सत्र12से बाहर होगा । महिला द्वारा बाहरी हरकत आंदोलनों की कमी के साथ, जो पुरुष के साथ यौन बातचीत के घटकों के साथ संबद्ध किया जा सकता है vivo विद्युत रिकॉर्डिंग में प्राप्त किया जा सकता है ।
हंसटर में Copulatory डटकर
परीक्षण कक्ष में एक पुरुष उत्तेजना जानवर की शुरूआत के बाद, पुरुष शुरू में उसे (चित्रा 2) बढ़ते पहले महिला के anogenital जांच (एअर इंडिया) में संलग्न होगा । आदेश में पुरुष के लिए माउंट करने के लिए, महिला एक ग्रहणशील यौन अग्रकुब्जता के रूप में जाना जाता है, जिसमें वह उसे वापस मेहराब और उसकी पूंछ इतना है कि बढ़ते पुरुष उसकी योनि के लिए शिश्न का उपयोग हासिल कर सकते है के रूप में जाना जाता मुद्रा ग्रहण करना चाहिए । पुरुष महिला माउंट, दोनों पंजे के साथ उसके hindquarters (चित्रा 2बी) अकवार, और एक शिश्न intromission (चित्रा 2सी) हासिल करने के प्रयास में जोर शुरू करते हैं । पुरुष (प्रविष्टि के बिना) के रूप में अच्छी तरह से अंततः स्खलन को प्राप्त करने से पहले कई बार intromit महिला माउंट होगा । mounts और स्खलन के लिए अग्रणी intromissions के इस अनुक्रम एक “copulatory मुक्केबाज़ी” करार है । नर एक ही सत्र के भीतर कई copulatory डटकर होगा ।
Protocol
यहाँ वर्णित सभी प्रक्रियाएँ संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा मिनेसोटा विश्वविद्यालय के अनुमोदित की गईं, और प्रयोगशाला पशुओं के देखभाल और उपयोग के लिए मार्गदर्शिका के अनुसार < सुप वर्ग = …
Representative Results
Discussion
हालांकि अपेक्षाकृत सरल, कुछ मुद्दों जब इस तकनीक को रोजगार पैदा कर सकते हैं । सबसे पहले, जांच के stereotaxic स्थान सटीक होना चाहिए: microdialysis के विपरीत है कि नमूनों की जांच आसपास के extracellular वातावरण के एक व्यापक त्रिज्या…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक अपनी मदद के लिए Matlab कोड और स्नातक एलेक्स Boettcher चलाने में व्यवहार प्रयोगों चलाने में उनकी सहायता के लिए स्नातक डैनियल कोरुस शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इस परियोजना NSF IOS १२५६७९९ के लिए R.L.M. द्वारा समर्थित है, और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान पुरस्कार संख्या T32DA007234 के तहत राष्ट्रीय संस्थानों की नशीली दवाओं के दुरुपयोग पर ।
Materials
| Nembutal | Oak Pharmaceuticals Inc. | 76478-501-50 | Pentobarbital sodium injection, USP. This lab uses 8.5mg/100g body weight, injected intraperotineally. |
| Loxicom analgesic | Norbrook Laboratories | 6451603670 | NSAID antinflammatory and analgesic used for post-operative pain control. Generic: meloxicam. |
| Enroflox antibiotic | Norbrook Laboratories | 5552915411 | Fluoroquinolone antibiotic for post-operative infection prevention. Generic: Enrofloxacin. |
| Beuthanasia-D | Merck Animal Health | 00061047305 | Pentobarbital Sodium, Phenytoin Sodium euthanasia agent. |
| Bone screws | Pinnacle Technologies, Inc. | 8111-16 | 1/8" bone screw (Pkg. of 16) used to affix skull cap to skull. |
| Dental acrylic (Bosworth Duz-All) | Bosworth | 166261C | Self curing dental acrylic is used in construction of a skull cap to affix cannula and head mount to skull. |
| Hardware biosensor setup | Pinnacle Technologies, Inc. | 8400-K2 | Pinnacle offers complete hardware kits for new users of our tethered biosensor system for rats. Kits include a commutator, preamplifier, and data conditioning and acquisition system |
| Base video computer package | Pinnacle Technologies, Inc. | 9000-K1 | The base computer package includes a preconfigured computer with ample hard disk storage, a high-definition monitor, a keyboard and mouse, an uninterruptible power supply, and all necessary cables. |
| Video EQ700 EverFocus camera package | Pinnacle Technologies, Inc. | 9000-K10 | EQ700 night vision capable box camera with independent IR source was obtained as part of Pinnacle video computer package. Dome camera (9000-K9) and HD camera (9000-K11) options are also available. |
| Sirenia Acquisition software | Pinnacle Technologies, Inc. | Free–available to download from pinnaclet.com | Sirenia Acquisition provides a single platform for recording data from any Pinnacle hardware system. The software features synchronization of all data streams, user-configurable settings, data consolidation, and multiple export options. In addition, the software includes basic review and analysis modules for biosensor recordings. Sirenia delivers free ll-in-one software that is ideal for data acquisition and review. |
| Tethered rat in vitro calibration kit | Pinnacle Technologies, Inc. | 7000-K2-T-BAS | In order to relate the current changes measured by a biosensor to actual changes in analyte concentration, it is necessary to calibrate the biosensor prior to implantation into the animal. The process also confirms the integrity and selectivity of the sensors. Calibration kit includes 20 mL jacketed beaker (#7058), 1/2" by 1/8" magnetic stir bar (#7059), right angle clamp (#7056), 2 prong single-adjustment clamp (#7055), 4-channel calibration preamplifer (#7053), and calibration holder (#7051). |
| Stir plate | Corning | 6795-410D | Corning digital Stirrer, 5" x 7", 120 VAC used to spin magnetic stirrer in jacketed beaker during in vitro calibration of glutamate biosensors. |
| Water bath capable of closed loop circulation | PolyScience | 8006A11B | PolyScience 8006A11B 6L Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC water bath was used with plastic tubing to heat jacketed beaker to physiological temperature. |
| Carbon fiber sensor with BASi rat cannulae | Pinnacle Technology, Inc. | 7002-CFS | Carbon fiber electrode used for recording dopamine neurotransmission. |
| Ag/AgCl reference electrode | Pinnacle Technology, Inc. | 7065 | Necessary for carbon fiber recordings. |
| Glutamate biosensors | Pinnacle Technology, Inc. | 7001 | Enzymatic biosensor probe used for recording glutamatergic neurotransmission. |
| BASi guide cannulae | Pinnacle Technologies, Inc. | 7030 | Guide cannulae implanted into brain region of interest to guide probe. |
| BASi cannula plastic headpiece for rats | Pinnacle Technologies, Inc. | 7011 | Headmount stabilizes probe and attaches to potentiostat. |
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