Мышиных холин недостаточным, дополнены Ethionine (CDE) модель хронической травмы печени диета
Summary
Здесь мы описываем общий метод, чтобы вызвать хронические повреждения печени в мышах, кормления Дефицит холина и ethionine дополнены диеты (CDE). Мы демонстрируем, наблюдение за работоспособностью, печени перфузии, изоляции и сохранения. Время курса шесть недель может сообщить о повреждения печени, Патогистологический центр, фиброз, воспалительных и печени прогениторных клеток ответов.
Abstract
Хронические заболевания печени, таких как вирусный гепатит, алкогольная болезнь печени или Безалкогольные жирная болезнь печени, характеризуются постоянной воспаления, прогрессивного разрушения и регенерации печеночной паренхимы печени прогениторных клеток распространение и фиброза. Терминальная стадия все хронические заболевания печени-цирроз, основным фактором риска для развития гепатоцеллюлярной карциномы. Для изучения процессов, регулирующих начало болезни, создание и прогрессии, несколько животных модели используются в лабораториях. Здесь мы описываем шестинедельный курс холин недостаточным и дополнены ethionine (CDE) мыши модели, которая включает в себя питание шесть – неделя старый самцов мышей C57BL/6J холин недостаточным Чоу и 0,15% DL-ethionine дополнить питьевой водой. Мониторинг здоровья животных и Кривая потери веса типичный тела объясняются. Протокол демонстрирует брутто экспертизы CDE-лечение печени и крови коллекции сердца прокол для анализа последующих сыворотки. Далее печени перфузии технику и сбор различных печеночная лопастями для стандартных оценок являются оценки показали, в том числе печени гистология гематоксилином и эозином или Сириус красный stainings, immunofluorescent обнаружения печеночная клеточных популяций а также транскриптом профилирование печени микроокружения. Эта модель мыши подходит для изучения воспалительных, Фиброгенные и печени прогениторных клеток динамика индуцированных через хронические заболевания печени и может использоваться для проверки потенциальных терапевтических агентов, которые могут модулировать эти процессы.
Introduction
Печень является самым большим органом железистой метаболизм тела и имеет множество сложных функций. Ключевые роли для печени включают пищеварение, обмен веществ, детоксикации, хранения необходимых питательных веществ, производство компонентов белков плазмы крови и иммунитета, опосредованного через резидентов макрофаги или клеток Купфера. Печень имеет большую способность восстанавливаться, даже если до 70-90% его общей массы теряется. В случае острого повреждения печени такие, как видно после частичной гепатектомии или ацетаминофен отравления, оставшиеся здоровые гепатоцитов размножаться для ремонта повреждений в весьма скоординированного процесса1. Однако, когда гепатоцитов хронически травму из-за долгосрочной вирусной инфекции, алкогольные или Безалкогольные жирная болезнь печени, воспалительные микроокружения вызывает активацию клеток вождения фиброз печени севрюга и пролиферацию клеток печени Прародителя (LPC) способны дифференцироваться в cholangiocytes или гепатоцитов2,3,4,5. Точное происхождение, дифференциация судьба LPCs, их вклад регенерации печени и hepatocarcinogenesis были темы интенсивных дебатов и скорее зависят от тяжести травмы и контекст2. Порядок начала регенерации связанных событий также состязательно обсужена, с некоторые следователи, заявив, что активации севрюга печеночных клеток и ремонт матрицы имеет важное значение для поколения ЛСМ в пользу нишу6, тогда как другие отчет, что расширение ЛСМ и так называемые Ductular реакции необходимы для триггера fibrogenesis7. Существует множество животных моделей для изучения конкретных аспектов травмы и регенерации, в попытке понять основополагающие факторы, которые регулируют прогрессирования заболевания и в конечном итоге разработать новые стратегии лечения для пациентов8.
Холин недостаточным и дополнены ethionine (CDE) диетическое модель была первоначально разработана для использования в крыс и позднее изменено для индукции хронической травмы печени в мышах9,10. Диетический дефицит холина приводит к ослабленным Ассамблеи и секрецию липопротеиды очень низкой плотности. В сочетании с hepatocarcinogen DL-ethionine, этот режим приводит к чрезмерной печеночная жира загрузки, непрерывной воспаление, перипортальный фиброз, ЛСМ ответ и долгосрочные гепатоцеллюлярной карциномы развития11,12 . Однако, важно, разные мыши штаммов экспонат отличительных моделей воспалительных, Фиброгенные и ЛСМ ответ динамики13. Этот протокол описывает хронической травмы печени индукции мышей C57BL/6J, наиболее часто используемые инбредных мыши штамма.
В исследованиях хронической болезни печени типичный анализы включают гистологические оценки гематоксилином и эозином, а также Сириус красное окрашивание визуализировать коллаген осаждений, иммуногистохимических или immunofluorescent обнаружения печеночная клеточных популяций, и транскриптомики анализов печени микроокружения, который оркеструет индуцированных клеточных изменений через комплекс факторов роста и цитокинов сети14,,1516,17 , 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хронические заболевания печени часто молчание болезни с большинства пациентов, будучи бессимптомно и это один из основных вкладчиков в заболеваемости и смертности во всем мире. Хронический алкоголизм и инфицирования вирусом гепатита являются ведущими причинами. Хроническое поврежд?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана субсидии от национального здравоохранения и медицинских исследований Совета (NHMRC) Австралии (APP1042370, APP1061332, APP1087125). Авторы хотели бы поблагодарить Кертин здравоохранения инновационной научно-исследовательский институт сотрудников для оказания технической помощи.
Materials
| Six-week-old male C57BL/6J mice | Animal Resource Centre of Western Australia, Murdoch, WA, Australia | N/A | |
| 10 Kg Steam Cut Wheaten Chaff | Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Australia | N/A | |
| Water for irrigation 1000ml bottle (Baxter) | Surgical House, Perth, WA, Australia | AHF7114A | |
| Choline- deficient diet, modified (pellets) | MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Australia 02960210 | ||
| DL-Ethionine | Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia | E5139-25G | |
| Ketamil injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| Ilum Xylazil-20 injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| 27G x 1/2", Regular Wall Needle | Terumo Australia Pty Limited, NSW, Australia | NN-2713R | |
| Syringes Terumo 1ml and 10ml | Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, NSW, Australia | 1018242, 1018037 | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 25608-930 | |
| Neutral buffered formalin | Amber Scientific, Midvale, WA, Australia | NBF-2.5L | |
| Ethanol absolute anaLaR normalpur | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 20821.33 | |
| Superfrost Plus slides | Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Australia | SF41296SP | |
| Dako Protein Block, serum-free | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | X090930-2 | |
| Dako antibody diluent | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | s0809 | |
| rat anti-CD45 | eBioscience, San Diego, California, USA | m0701 | 1/200 dilution |
| rabbit anti-panCK | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | Z0622 | 1/300 dilution |
| Goat anti-rabbit (Alexa Fluor 488) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11008 | 1/500 dilution |
| Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 594) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11007 | 1/500 dilution |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | P36935 | |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences Inc., Warrington, PA, USA | ab150681 | |
References
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 836-847 (2004).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310, G143-G154 (2016).
- Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17, 971-983 (2015).
- Prakoso, E., et al. Analysis of the intrahepatic ductular reaction and progenitor cell responses in hepatitis C virus recurrence after liver transplantation. Liver Transpl. 20, 1508-1519 (2014).
- Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39, 2226-2239 (2007).
- Van Hul, N. K., Abarca-Quinones, J., Sempoux, C., Horsmans, Y., Leclercq, I. A. Relation between liver progenitor cell expansion and extracellular matrix deposition in a CDE-induced murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 1625-1635 (2009).
- Clouston, A. D., et al. Fibrosis correlates with a ductular reaction in hepatitis C: roles of impaired replication, progenitor cells and steatosis. Hepatology. 41, 809-818 (2005).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration – mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13, 473-485 (2016).
- Akhurst, B., et al. A modified choline-deficient, ethionine-supplemented diet protocol effectively induces oval cells in mouse liver. Hepatology. 34, 519-522 (2001).
- Shinozuka, H., Lombardi, B., Sell, S., Iammarino, R. M. Early histological and functional alterations of ethionine liver carcinogenesis in rats fed a choline-deficient diet. Cancer Res. 38, 1092-1098 (1978).
- Knight, B., Tirnitz-Parker, J. E., Olynyk, J. K. C-kit inhibition by imatinib mesylate attenuates progenitor cell expansion and inhibits liver tumor formation in mice. Gastroenterology. 135, 969-979 (2008).
- Kohn-Gaone, J., et al. Divergent Inflammatory, Fibrogenic, and Liver Progenitor Cell Dynamics in Two Common Mouse Models of Chronic Liver Injury. Am J Pathol. 186, 1762-1774 (2016).
- Knight, B., et al. Attenuated liver progenitor (oval) cell and fibrogenic responses to the choline deficient, ethionine supplemented diet in the BALB/c inbred strain of mice. J Hepatol. 46, 134-141 (2007).
- Dwyer, B. J., Olynyk, J. K., Ramm, G. A., Tirnitz-Parker, J. E. TWEAK and LTbeta Signaling during Chronic Liver Disease. Front Immunol. 5, 39 (2014).
- Karin, M., Clevers, H. Reparative inflammation takes charge of tissue regeneration. Nature. 529, 307-315 (2016).
- Ruddell, R. G., et al. Lymphotoxin-beta receptor signaling regulates hepatic stellate cell function and wound healing in a murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 227-239 (2009).
- Tirnitz-Parker, J. E., et al. Tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis is a mitogen for liver progenitor cells. Hepatology. 52, 291-302 (2010).
- Viebahn, C. S., Yeoh, G. C. What fires prometheus? The link between inflammation and regeneration following chronic liver injury. Int J Biochem Cell Biol. 40, 855-873 (2008).
- Hayner, N. T., Braun, L., Yaswen, P., Brooks, M., Fausto, N. Isozyme profiles of oval cells, parenchymal cells, and biliary cells isolated by centrifugal elutriation from normal and preneoplastic livers. Cancer Res. 44, 332-338 (1984).
- Tee, L. B., Smith, P. G., Yeoh, G. C. Expression of alpha, mu and pi class glutathione S-transferases in oval and ductal cells in liver of rats placed on a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Carcinogenesis. 13, 1879-1885 (1992).
- Chayanupatkul, M., et al. Hepatocellular carcinoma in the absence of cirrhosis in patients with chronic hepatitis B virus infection. J Hepatol. 66, 355-362 (2017).
- Mittal, S., et al. Hepatocellular Carcinoma in the Absence of Cirrhosis in United States Veterans is Associated With Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 14, 124-131 (2016).
