Le murin déficients en Choline, additionné d’éthionine (CDE) alimentation modèle d’atteinte hépatique chronique
Summary
Nous décrivons ici une méthode commune pour induire des lésions chroniques du foie chez les souris en se nourrissant d’un régime alimentaire (CDE) déficients en choline et additionné d’éthionine. Nous démontrons la surveillance de la santé, perfusion hépatique, d’isolement et de préservation. Une durée de six semaines peut informer d’atteinte hépatique, pathohistology, fibrose, inflammation et les réponses des cellules progénitrices du foie.
Abstract
Maladies chroniques du foie, comme l’hépatite virale, maladie alcoolique du foie ou stéatose hépatique non alcoolique, sont caractérisent par l’inflammation continuelle, une destruction progressive et la régénération des cellules du parenchyme hépatique, foie prolifération et la fibrose. La phase terminale de chaque maladie chronique du foie est la cirrhose, un facteur de risque majeur pour le développement du carcinome hépatocellulaire. Afin d’étudier les processus régissant la progression, l’établissement et initiation de la maladie, plusieurs modèles animaux sont utilisés dans les laboratoires. Nous décrivons ici un cours de six semaines de temps du déficients en choline et additionné d’éthionine (CDE) souris modèle, qui consiste à nourrir six – semaine vieilles souris C57BL/6J mâles avec déficients en choline chow et 0,15 % DL-éthionine-complété en eau potable. Surveillance de la santé animale et une courbe de perte de poids de corps typiques sont expliqués. Le protocole montre l’examen brut d’une collection de traités CDE foie et le sang par ponction cardiaque pour des analyses ultérieures de sérum. Ensuite, la technique de perfusion hépatique et la perception des différents lobes hépatiques pour évaluations standards sont les quotes-parts indiquées, y compris l’histologie du foie par l’hématoxyline et éosine ou Sirius rouge salissures, détection par immunofluorescence des populations de cellules hépatiques ainsi que du transcriptome de profilage du microenvironnement du foie. Ce modèle de souris convient pour étudiant inflammatoires, fibrogène et cellules hépatiques dynamique induite par une maladie hépatique chronique et peut être utilisée pour tester les agents thérapeutiques potentiels qui peuvent moduler ces processus.
Introduction
Le foie est le plus grand organe glandulaire métabolique du corps et a de nombreuses fonctions complexes. Les rôles principaux pour le foie comprennent la digestion, métabolisme, détoxification, stockage d’éléments nutritifs essentiels, la production de composants de protéine de plasma sanguin et immunité médiée par des macrophages résidents ou des cellules de Kupffer. Le foie a une grande capacité à se régénérer même si jusqu’à 70-90 % de sa masse totale est perdue. En cas d’atteinte hépatique aiguë, comme vu après une hépatectomie partielle ou acetaminophen l’empoisonnement, les hépatocytes sains restants se multiplient pour réparer les dégâts dans un processus hautement coordonnée1. Toutefois, lorsque les hépatocytes sont chroniquement blessés due à une infection virale à long terme, alcoolisée ou non alcoolisées stéatose hépatique, le microenvironnement inflammatoire déclenche l’activation des cellules étoilées hépatiques fibrose-conduite et les prolifération de cellules progénitrices du foie (LPCs) susceptibles de se différencier en cholangiocytes ou hépatocytes2,3,4,5. L’origine précise, sort de la différenciation des suppléments de retard, leur contribution à la régénération du foie et hepatocarcinogenesis ont été des sujets de débats intenses et très probablement dépendent de la gravité des blessures et le contexte2. L’ordre des événements précoces associées à régénération est aussi controversée, avec quelques chercheurs indiquant que l’activation des cellules étoilées hépatique et le remodelage de la matrice est essentielle pour la production d’un favorable de LPC niche6, tandis que d’autres rapport que l’expansion LPC et la réaction dite de canaux sont nécessaires pour déclencheur FIBROGÉNÈSE7. Il existe de nombreux modèles animaux pour l’étude des aspects spécifiques des blessures et la régénération, dans une tentative pour comprendre tous les facteurs sous-jacents qui régulent la progression de la maladie et en fin de compte développer de nouvelles stratégies de traitement pour les patients8.
Le modèle alimentaire déficients en choline et additionné d’éthionine (CDE) a été initialement développé pour l’usage chez les rats et par la suite modifié pour l’induction des lésions hépatiques chroniques dans souris9,10. Une carence alimentaire de choline résulte en Assemblée avec facultés affaiblies et la sécrétion des lipoprotéines de basse densité très. Combiné avec le hépatocancérogène DL-éthionine, ce régime conduit à l’excès de gras hépatique, de chargement continue inflammation, fibrose périportale, réponse de la LPC et à long terme à hepatocellular carcinoma développement11,12 . Cependant, ce qui est important, souches de souris différentes pièce modèles distinctifs de fibrogène et du LPC inflammatoires, réponse dynamique13. Ce protocole décrit la souche de souris induction chez les souris C57BL/6J, les plus couramment utilisés consanguinitée atteinte hépatique chronique.
Dans la recherche d’une maladie hépatique chronique, analyses typiques incluent les évaluations histologiques de l’hématoxyline et éosine ainsi que la coloration rouge Sirius pour visualiser les dépôts de collagène, immunohistochimiques ou détection par immunofluorescence des populations de cellules hépatiques, et analyses transcriptomiques du microenvironnement du foie qui orchestre les changements cellulaires induites au complexe facteur de croissance et cytokines réseaux14,15,16,17 , 18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Maladie chronique du foie est souvent une maladie silencieuse avec la plupart des patients étant asymptomatiques et c’est l’un des grands contributeurs à la morbidité et de mortalité dans le monde entier. L’alcoolisme chronique et infection de virus de l’hépatite C sont les principales causes. Atteinte hépatique chronique est caractérisée par une inflammation hépatique, fibrose et cirrhose les cas graves, carcinome et insuffisance hépatique en fin de compte. Il n’existe actuellement aucun remède disp…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Health and Medical Research Council (NHMRC) de l’Australie (APP1042370, APP1061332, APP1087125). Les auteurs aimeraient remercier le personnel de Curtin Health Innovation Research Institute pour l’assistance technique.
Materials
| Six-week-old male C57BL/6J mice | Animal Resource Centre of Western Australia, Murdoch, WA, Australia | N/A | |
| 10 Kg Steam Cut Wheaten Chaff | Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Australia | N/A | |
| Water for irrigation 1000ml bottle (Baxter) | Surgical House, Perth, WA, Australia | AHF7114A | |
| Choline- deficient diet, modified (pellets) | MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Australia 02960210 | ||
| DL-Ethionine | Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia | E5139-25G | |
| Ketamil injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| Ilum Xylazil-20 injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| 27G x 1/2", Regular Wall Needle | Terumo Australia Pty Limited, NSW, Australia | NN-2713R | |
| Syringes Terumo 1ml and 10ml | Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, NSW, Australia | 1018242, 1018037 | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 25608-930 | |
| Neutral buffered formalin | Amber Scientific, Midvale, WA, Australia | NBF-2.5L | |
| Ethanol absolute anaLaR normalpur | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 20821.33 | |
| Superfrost Plus slides | Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Australia | SF41296SP | |
| Dako Protein Block, serum-free | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | X090930-2 | |
| Dako antibody diluent | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | s0809 | |
| rat anti-CD45 | eBioscience, San Diego, California, USA | m0701 | 1/200 dilution |
| rabbit anti-panCK | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | Z0622 | 1/300 dilution |
| Goat anti-rabbit (Alexa Fluor 488) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11008 | 1/500 dilution |
| Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 594) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11007 | 1/500 dilution |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | P36935 | |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences Inc., Warrington, PA, USA | ab150681 | |
References
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 836-847 (2004).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310, G143-G154 (2016).
- Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17, 971-983 (2015).
- Prakoso, E., et al. Analysis of the intrahepatic ductular reaction and progenitor cell responses in hepatitis C virus recurrence after liver transplantation. Liver Transpl. 20, 1508-1519 (2014).
- Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39, 2226-2239 (2007).
- Van Hul, N. K., Abarca-Quinones, J., Sempoux, C., Horsmans, Y., Leclercq, I. A. Relation between liver progenitor cell expansion and extracellular matrix deposition in a CDE-induced murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 1625-1635 (2009).
- Clouston, A. D., et al. Fibrosis correlates with a ductular reaction in hepatitis C: roles of impaired replication, progenitor cells and steatosis. Hepatology. 41, 809-818 (2005).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration – mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13, 473-485 (2016).
- Akhurst, B., et al. A modified choline-deficient, ethionine-supplemented diet protocol effectively induces oval cells in mouse liver. Hepatology. 34, 519-522 (2001).
- Shinozuka, H., Lombardi, B., Sell, S., Iammarino, R. M. Early histological and functional alterations of ethionine liver carcinogenesis in rats fed a choline-deficient diet. Cancer Res. 38, 1092-1098 (1978).
- Knight, B., Tirnitz-Parker, J. E., Olynyk, J. K. C-kit inhibition by imatinib mesylate attenuates progenitor cell expansion and inhibits liver tumor formation in mice. Gastroenterology. 135, 969-979 (2008).
- Kohn-Gaone, J., et al. Divergent Inflammatory, Fibrogenic, and Liver Progenitor Cell Dynamics in Two Common Mouse Models of Chronic Liver Injury. Am J Pathol. 186, 1762-1774 (2016).
- Knight, B., et al. Attenuated liver progenitor (oval) cell and fibrogenic responses to the choline deficient, ethionine supplemented diet in the BALB/c inbred strain of mice. J Hepatol. 46, 134-141 (2007).
- Dwyer, B. J., Olynyk, J. K., Ramm, G. A., Tirnitz-Parker, J. E. TWEAK and LTbeta Signaling during Chronic Liver Disease. Front Immunol. 5, 39 (2014).
- Karin, M., Clevers, H. Reparative inflammation takes charge of tissue regeneration. Nature. 529, 307-315 (2016).
- Ruddell, R. G., et al. Lymphotoxin-beta receptor signaling regulates hepatic stellate cell function and wound healing in a murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 227-239 (2009).
- Tirnitz-Parker, J. E., et al. Tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis is a mitogen for liver progenitor cells. Hepatology. 52, 291-302 (2010).
- Viebahn, C. S., Yeoh, G. C. What fires prometheus? The link between inflammation and regeneration following chronic liver injury. Int J Biochem Cell Biol. 40, 855-873 (2008).
- Hayner, N. T., Braun, L., Yaswen, P., Brooks, M., Fausto, N. Isozyme profiles of oval cells, parenchymal cells, and biliary cells isolated by centrifugal elutriation from normal and preneoplastic livers. Cancer Res. 44, 332-338 (1984).
- Tee, L. B., Smith, P. G., Yeoh, G. C. Expression of alpha, mu and pi class glutathione S-transferases in oval and ductal cells in liver of rats placed on a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Carcinogenesis. 13, 1879-1885 (1992).
- Chayanupatkul, M., et al. Hepatocellular carcinoma in the absence of cirrhosis in patients with chronic hepatitis B virus infection. J Hepatol. 66, 355-362 (2017).
- Mittal, S., et al. Hepatocellular Carcinoma in the Absence of Cirrhosis in United States Veterans is Associated With Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 14, 124-131 (2016).
