מי קולחין יזם: זיהוי ואפיון של השורש גולה יזם ספציפי בתוך השעועית נפוצות
Summary
ניתוח ביטוי יזם מכריעים לשיפור ההבנה של הכונה וביטוי ייתכן היעד גנים. במסמך זה אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות, לבודד לשבט מקדם הצמח. עוד יותר, אנו מתארים את האפיון של האמרגן גולה ספציפיים שורשים שעירים שעועית נפוצות.
Abstract
רצפי במעלה הגן קידוד רצפים מכונים כמו יזם רצפים. לומד את דפוסי ביטוי של היזמים הם מאוד משמעותיים בהבנת הכונה ודפוסי ייתכן ביטוי של גנים היעד. מצד שני, חשוב גם כדי ליצור כלי הערכה יזם טכניקות שינוי גנטי מהיר, יעיל, ו לשחזור. במחקר זה, חקרנו למשמעות הביטוי ייתכן הקמתה (נין) rhizobial ספציפיים סימביוזה גולה האמרגן של מצויה הטרנסגניים שורשים שעירים. צמח הגנום מסדי נתונים באמצעות כלי ניתוח זיהינו, מבודד, שיכפל את המקדם נין דלקתית פ ב פיוז’ן תעתיק לכתב chimeric β-glucuronidase (גאס) גאס-enhanced::GFP. יתרה מזאת, פרוטוקול זה מתאר מערכת מהירה ופסיביות של שינוי גנטי דלקתית פ באמצעות שורשים שעירים Agrobacterium rhizogenes המושרה. מערכת זו יוצרת שורשים שעירים ≥2 ס מ- 10 עד 12 ימים לאחר השינוי. בשלב הבא, אנחנו העריכו הביטוי ייתכן של יזם נין בשורשים שעיר ריזוביום מחוסן במרווחים תקופתיים של פוסט-חיסון. התוצאות שלנו מתואר על ידי גאס פעילות להראות כי ייצוג המקדם נין היה פעיל במהלך התהליך של nodulation. יחד, בפרוטוקול הנוכחי מדגים כיצד לזהות, לבודד, שיבוט, לאפיין את הצמח מקדם מכירות שורשים שעירים שעועית נפוצות. יתר על כן, פרוטוקול זה הוא קל לשימוש במעבדות שאינם מיוחדים.
Introduction
היזמים הם כלים חשובים ביולוגית מולקולרית אשר לשחק תפקיד מכריע בהבנת ויסות הביטוי של הגנים של עניין. היזמים נמצאים רצפי DNA ממוקם במעלה הזרם של התרגום codon חניכה של ג’ין רצף והן נושאות את המידע התקינה המרכזית של גנים; לכן, ביאור נכון ואפיון שלהם הם חיוניים להבנת תפקוד הגן. בהתאם דפוסי ביטוי, היזמים צמח מסווגים מכוננת, רקמות ספציפיות, או פיתוח הבמה- וספציפיים inducible1. ההתקדמות transcriptomic טכנולוגיות, שיפורים ממוחשבות, והזמינות של מספר גדל והולך של רצפי הגנום מיני צמחים שונים יש הקלה התחזית בקנה מידה גדול של רצפי יזם2.
מצד שני, חשוב גם כדי ליצור כלי הערכה יזם טכניקות שינוי גנטי מהיר, יעיל, ו לשחזור. בניגוד דגם צמחים אחרים, אפיון פונקציונלי נפוצים בין קטניות (פ דלקתית) גנים מופרעת בעיקר בגלל אופי Phaseolus sp. לשינוי גנטי יציב הסרבן. מערכות טרנספורמציה ארעי לשמש חלופה עבור ג’ין מהירה אפיון פונקציונלי מחקרים3. במחקר סימביוזה קטניות, האינטראקציה בין חיידק rhizobial מצמח פונדקאי קטניות היא אחת המערכות דגם צייתן ביותר לניתוח פונקציונלי של גנים ספציפיים גולה ולימודים קדם. כל-כך רחוק, מספר היזמים קטניות הקשורים symbioses אלה היה מאופיין, בילוי, אספסת truncatula PT44, SWEET115, לוטוס ג’אפוניכאס קיקלופ, UBQ6, VAG17, PT5 מקסימום גליצין 8, Exo70J9, RbohB דלקתית פ 10,11,12, TRE113, PI3K14, טור15, ועוד. חבר העמים גורמים משפיעים ישירות על הכונה. הפקטור שעתוק ENBP1A נקשר באזור רגולטוריות חבר העמים (−692 bp) של nodulin מוקדם VfENOD12, זה מקל על הביטוי של גן כתב ב גולה primordia בקיה faba16. החלפה של אזורים רגולטוריות חבר העמים (−161 כדי −48 bp) של האמרגן ספציפיים גולה leghemoglobin GLB3 עם heterologous נחתכות היזמים אלפא-p35S, אלפא-פסנתרים, גרמו לאובדן היחודיות גולה ו מופחתת יזם פעילות17 .
בדו”חות קודמים מראים את גורם שעתוק נין נדרש עבור אתחול של זיהום rhizobial לתאי השורש, גם חיוני גולה organogenesis ג’אפוניכאס ל’18. במחקר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול זיהוי, בידוד, שיבוט של אפיון של גולה ספציפיים יזם שורשים שעירים שעועית נפוצות. כדי להשיג זאת, אנו נבחר מקדם נין סימביוזה ספציפי rhizobial וולגריס פ , שיכפל ב פיוז’ן תעתיק לכתב chimeric גאס-enhanced::GFP. יתרה מזאת, פרוטוקול זה מתאר מערכת מהירה ופסיביות של שינוי גנטי דלקתית פ באמצעות שורשים שעירים rhizogenes א המושרה. מערכת זו יוצרת שורשים שעירים פחות משבועיים לאחר השינוי. בסופו של דבר, אנחנו העריכו הביטוי ייתכן נין יזם ב- rhizobia התנחלו פקעיות מאת GUS מכתים.
ההליך המתואר כאן עשוי להיות שימושי לא רק לצורך המחקר של nodulation ו- mycorrhization11 צמחים קטניות, אלא גם לצורך המחקר דפוסי ביטוי יזם שורשים19. יתר על כן, פרוטוקול זה הוא קל לשימוש במעבדות שאינם מיוחדים.
Protocol
Representative Results
Discussion
במהלך אנליזה פונקציונלית של גנים, המחקר של דפוסי ביטוי הגנים ממלא תפקיד מכריע בהבנת יכולות ויסות הגנים ויוו. שיטה ידועה ללמוד דפוסי ביטוי גנים הוא לשבט את האזור יזם גנים של עניין, במעלה כתב גנים כגון גנים סמן פלורסנט (GFP, RFP, וכו ‘) או β-glucuronidase. במסמך זה, בחרנו אזור יזם השורש גולה סימב…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומן בחלקו על ידי הגנרל Dirección דה Asuntos דל Académico אישי, DGAPA/PAPIIT-UNAM (מענק. לא. IN219916 M.L, IA205117 ל ז-ק… A) ו- y Consejo נאסיונאל דה Ciencia Tecnològia (CONACYT מענק מס 240614 מ. ל).
Materials
| Primers for qRT-PCR assay | |||
| pNIN Forward | CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT | ||
| pNIN Reverse | CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C | ||
| M13 Forward | GTA AAA CGA CGG CCA G | ||
| M13 Reverse | CAG GAA ACA GCT ATG AC | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K243520 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Invitrogen | 11791100 | |
| pBGWFS7.0 | Plant systems biology | https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/ | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | ThermoFisher Scientific | K210012 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Certified Molecular Biology Agarose | Bio-Rad | 1613102 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293-250G | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-250G | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306-1KG | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615-25G | |
| Spectinomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1441 | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Bacteriological peptone | Sigma-Aldrich | P0556 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Nalidixic acid | Sigma-Aldrich | N8878 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Gel loading solution | Sigma-Aldrich | G7654 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Thermocycler | Veriti Thermal Cycler | 4375786 | |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 1-14K | |
| Gel documentation unit | Carestream | Gel Logic 212 PRO | |
| MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator – 115VAC | Thermo scientific | EW-51708-70 | |
| Plant growth chamber | MRC | PGI-550RH | |
| Horizantal laminarair flow cabinate | Lumistell | LH-120 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM4500 B | |
| Petridish | sym laboratorios | 90X15 | |
| Scalpel Blade | Fisher scientific | 53223 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| 22 mL glass tubes | Thomas scientific | 45048-16150 |
References
- Hernández-Garcia, C. M., Finer, J. J. Identification and validation of promoters and cis-actingregulatory elements. Plant Science. 217-218, 109-119 (2014).
- Dhanapal, A. P., Govindaraj, M. Unlimited Thirst for Genome Sequencing, Data Interpretation, and Database Usage in Genomic Era: The Road towards Fast-Track Crop Plant Improvement. Genetics Research International. , 684321 (2015).
- Nanjareddy, N., Arthikala, M. K., Blanco, L., Arellano, E. S., Lara, M. Protoplast isolation, transient transformation of leaf mesophyll protoplasts and improved Agrobacterium-mediated leaf disc infiltration of Phaseolus vulgaris: Tools for rapid gene expression analysis. BMC Biotechnol. 16 (1), 53 (2016).
- Pumplin, N., Zhang, X., Noar, R. D., Harrison, M. J. Polar localization of a symbiosis-specific phosphate transporter is mediated by a transient reorientation of secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (11), E665-E672 (2012).
- Kryvoruchko, I. S., et al. MtSWEET11, a Nodule-Specific Sucrose Transporter of Medicago truncatula. Plant Physiol. 171 (1), 554-565 (2016).
- Suzaki, T., Yano, K., Ito, M., Umehara, Y., Suganuma, N., Kawaguchi, M. Positive and negative regulation of cortical cell division during root nodule development in Lotus japonicus is accompanied by auxin response. Development. 139 (21), 3997-4006 (2012).
- Suzaki, T., et al. Endoreduplication-mediated initiation of symbiotic organ development in Lotus japonicus. Development. 141 (12), 2441-2445 (2014).
- Qin, L., et al. The high-affinity phosphate transporter GmPT5 regulates phosphate transport to nodules and nodulation in soybean. Plant Physiol. 159 (4), 1634-1643 (2012).
- Wang, Z., Panfeng, L., Yan, Y., Chi, Y., Fan, B., Chen, Z. Expression and Functional Analysis of a Novel Group of Legume-specific WRKY and Exo70 Protein Variants from Soybean. Sci Rep. 6, 32090 (2016).
- Montiel, J., et al. A Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene is required for root infection by Rhizobia. Plant Cell Physiol. 53 (10), 1751-1767 (2012).
- Arthikala, M. K., et al. PvRbohB negatively regulates Rhizophagus irregularis colonization in Phaseolus vulgaris. Plant Cell Physiol. 54 (8), 1391-1402 (2013).
- Arthikala, M. K., Sánchez-López, R., Nava, N., Santana, O., Cárdenas, L., Quinto, C. RbohB a Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene, enhances symbiosome number, bacteroid size, and nitrogen fixation in nodules and impairs mycorrhizal colonization. New Phytol. 202 (3), 886-900 (2014).
- Barraza, A., et al. Down-regulation of PvTRE1 enhances nodule biomass and bacteroid number in the common bean. New Phytol. 197 (1), 194-206 (2013).
- Estrada-Navarrete, G., et al. An autophagy-related kinase is essential for the symbiotic relationship between Phaseolus vulgaris and both rhizobia and arbuscular mycorrhizal fungi. Plant Cell. 28 (9), 2326-2341 (2016).
- Nanjareddy, K., et al. A Legume TOR Protein Kinase Regulates Rhizobium Symbiosis and Is Essential for Infection and Nodule Development. Plant Physiol. 172 (3), 2002-2020 (2016).
- Frühling, M., Schröder, G., Hohnjec, N., Pühler, A., Perlick, A. M., Küster, H. The promoter of the Vicia faba L. gene VfEnod12 encoding an early nodulin is active in cortical cells and nodule primordia of transgenic hairy roots of Vicia hirsuta as well as in the prefixing zone II of mature transgenic V. hirsuta root nodules. Plant Science. 160 (1), 67-75 (2000).
- Szabados, L., Ratet, P., Grunenberg, B., de Bruijn, F. J. Functional analysis of the Sesbania rostrata leghemoglobin glb3 gene 5′-upstream region in transgenic Lotus corniculatus and Nicotiana tabacum plants. Plant Cell Online. 2 (10), 973-986 (1990).
- Madsen, L. H., Tirichine, L., Jurkiewicz, A., Sullivan, J. T., Heckmann, A. B., Bek, A. S., Ronson, C. W., James, E. K., Stougaard, J. The molecular network governing nodule organogenesis and infection in the model legume Lotus japonicus. Nat Commun. 12, 1-10 (2010).
- Montiel, J., Arthikala, M. K., Quinto, C. Phaseolus vulgaris RbohB functions in lateral root development. Plant Signal Behav. 8 (1), 1-3 (2013).
- Nanjareddy, K., Arthikala, M. K., Gómez, B. M., Blanco, L., Lara, M. Differentially expressed genes in mycorrhized and nodulated roots of common bean are associated with defense, cell wall architecture, N metabolism, and P metabolism. PLoS ONE. 12 (8), e0182328 (2017).
- Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. Gateway vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
- Broughton, W. J., Dilworth, M. J. Control of leghemoglobin synthesis in snake beans. Biochem J. 125 (4), 1075-1080 (1971).
- Jefferson, R. A. Assaying chimeric genes in plants, the GUS gene fusion system. Plant Mol Biol Rep. 5 (4), 387-405 (1987).
- Cho, H. J., Farrand, S. K., Noel, G. R., Widholm, J. M. High-efficiency induction of soybean hairy roots and propagation of the soybean cyst nematode. Planta. 210 (2), 195-204 (2000).
- Deng, Y., Mao, G., Stutz, W., Yu, O. Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays. J. Vis. Exp. (49), e2633 (2011).
- Kumagai, H., Kouchi, H. Gene silencing by expression of hairpin RNA in Lotus japonicus roots and root nodules. Mol Plant Microbe Interact. 16 (8), 663-668 (2003).
- Okamoto, S., Yoro, E., Suzaki, T., Kawaguchi, M. Hairy Root Transformation in Lotus japonicus. Bio-protocol. 3 (12), e795 (2013).
- Jacobs, T. B., Martin, G. B. High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots. J. Vis. Exp. (110), e53843 (2016).
- Estrada-Navarrete, G., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformation of the Phaseolus spp.: a tool for functional genomics. Mol Plant Microbe Interact. 19 (12), 1385-1393 (2006).
