Anläggningen arrangören analys: Identifiering och karakterisering av roten knöl specifika promotorn i gemensamma bönan
Summary
Arrangören uttryck analyser är avgörande för att förbättra förståelsen av genreglering och spatiotemporal uttrycket av målgener. Här presenterar vi ett protokoll för att identifiera, isolera och klona en växt promotor. Vidare beskriver vi karakterisering av den knöl-specifika promotorn i gemensamma bean hårig rötterna.
Abstract
Uppströms sekvenser av gen kodande sekvenser kallas som arrangören sekvenser. Studera de uttrycksmönster av initiativtagare är mycket betydande i förståelsen av genreglering och spatiotemporal uttrycksmönster av målgener. Däremot, är det också avgörande för att fastställa verktyg för utvärdering av promotorn och genetisk transformation tekniker som är snabb, effektiv och reproducerbara. I denna studie undersökte vi spatiotemporal uttrycksmönstret av rhizobial symbios-specifika knöl starten (NIN) arrangören av Phaseolus vulgaris i transgena hårig rötterna. Använda växten arvsmassa databaser och analysverktyg som vi identifierat, isolerat och klonade P. vulgaris NIN arrangören i en transkriptionell fusion till chimära reporter β-glukuronidas (GUS) GUS-enhanced::GFP. Ytterligare, det här protokollet beskriver ett snabba och mångsidiga system för genetisk transformation i P. vulgaris med hjälp av Agrobacterium rhizogenes inducerad håriga rötter. Detta system genererar ≥2 cm håriga rötter på 10 till 12 dagar efter transformation. Nästa, vi bedömde spatiotemporal uttrycket av NIN arrangören i Rhizobium inokuleras håriga rötter med regelbundna mellanrum av efter inympningen. Våra resultat som skildras av GUS aktivitet visar att promotorn NIN var aktiva under processen av nodulationen. Tillsammans, visar detta protokoll hur till identifiera, isolera, klona och karakterisera en växt promotor i gemensamma bean hårig rötterna. Detta protokoll är dessutom lätt att använda i icke-specialiserade laboratorier.
Introduction
Initiativtagare är viktiga molekylär biologiska verktyg som spelar en avgörande roll i förståelsen regleringen av uttrycket av gener av intresse. Initiativtagare är DNA-sekvenser som ligger uppströms av översättningen inledandet kodon av genen sekvenser och de bär den centrala föreskrifter av gener; sin rätt anteckning och karakterisering är därför avgörande för att förstå geners funktion. Beroende på uttrycket mönstren klassificeras anläggningen initiativtagare som konstituerande, vävnadsspecifika, eller utveckling-scenen-specifika och inducerbara1. Framsteg inom transcriptomic teknik, förbättringar i datormodellering och tillgängligheten av ökande antal genomet sekvenser för olika växtarter har underlättat storskaliga förutsägelse av promotorn sekvenser2.
Däremot, är det också avgörande för att fastställa verktyg för utvärdering av promotorn och genetisk transformation tekniker som är snabb, effektiv och reproducerbara. Till skillnad från de andra plantorna för modell hindras funktionell karakterisering av gemensamma bean baljväxter (P. vulgaris) gener främst på grund av hur motsträviga Phaseolus sp. för stabil genetisk transformation. Övergående omvandling system fungera som ett alternativ för snabb gen funktionell karakterisering studier3. I baljväxter symbios forskning är samspelet mellan baljväxter värdväxt och rhizobial bakterien en av de mest lätthanterlig modellsystem för den funktionella analysen av knöl-specifika gener och arrangören studier. Hittills har flera baljväxter initiativtagare relaterade till dessa Symbiosar har varit kännetecknas, nämligen, Medicago truncatula PT44, SWEET115, Lotus japonicus Cyclops, UBQ6, VAG17, Glycine max PT5 8, Exo70J9, P. vulgaris RbohB10,11,12, TRE113, PI3K14, TOR15, etc. CIS element direkt påverka genreglering. Transkriptionsfaktor ENBP1A binder till en Cis regulatoriska region (−692 bp) i tidig nodulin VfENOD12, och detta underlättar uttrycket av en reporter gen i knöl primordia Vicia faba16. Byte av Cis regulatoriska regioner (−161 till −48 bp) av den knöl-specifika promotorn leghemoglobin GLB3 med den heterologa trunkeras initiativtagare δ-p35S och δ-pNOS, resulterade i en förlust av knöl specificitet och reducerad arrangören aktivitet17 .
Tidigare rapporter visar att den transkriptionsfaktor NIN krävs för inledande av rhizobial infektion i roten hårcellerna och är också viktigt för knöl organogenes hos L. japonicus18. I föreliggande studie beskriver vi ett protokoll för identifiering, isolering, kloning och karakterisering av knöl-specifika promotorn i gemensamma bean hårig rötterna. För att uppnå detta, vi valde en rhizobial symbios-specifika NIN promotorn av P. vulgaris och klonade i en transkriptionell fusion till chimära reporter GUS-enhanced::GFP. Ytterligare, det här protokollet beskriver ett snabba och mångsidiga system för genetisk transformation i P. vulgaris med A. rhizogenes inducerad håriga rötter. Detta system genererar håriga rötter i mindre än 2 veckor efter transformation. Slutligen bedömde vi spatiotemporal uttrycket av NIN arrangören i kväveformer koloniserade rot knölar av GUS färgning.
Proceduren som beskrivs här kan vara användbart för studien av nodulationen och mycorrhization11 av baljväxter växter, men också för studier av promotorn uttrycksmönster i rötter19. Detta protokoll är dessutom lätt att använda i icke-specialiserade laboratorier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Under funktionell analys av gener spelar studiet av genen uttrycksmönster en avgörande roll i att förstå rumsliga och tidsmässiga regleringen av gener i vivo. En välkänd metod för att studera gen uttrycksmönster är att klona gen promotor regionen av intresse, uppströms till reporter gener som fluorescerande markörgener (GFP, RFP, etc.) eller β-glukuronidas. Häri, har vi valt en promotor regionen av roten knöl symbios (RNS) specifika genen, NIN, att studera plats och tid uttrycksmönster i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete var delvis stöds av Dirección General de Asuntos del personliga Académico, DGAPA/PAPIIT-UNAM (bevilja nr. IN219916 till M.L och IA205117 till M-K. (A) och Consejo Nacional de Ciencia y Tecnològia (CONACYT grant nr 240614 att M.L.).
Materials
| Primers for qRT-PCR assay | |||
| pNIN Forward | CACC ATA GCT CCC CAA AAT GGT AT | ||
| pNIN Reverse | CAT CTT CCT TCC ACT AAC TAA C | ||
| M13 Forward | GTA AAA CGA CGG CCA G | ||
| M13 Reverse | CAG GAA ACA GCT ATG AC | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K243520 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Invitrogen | 11791100 | |
| pBGWFS7.0 | Plant systems biology | https://gateway.psb.ugent.be/vector/show/pBGWFS7/search/index/ | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966018 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | ThermoFisher Scientific | K210012 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Certified Molecular Biology Agarose | Bio-Rad | 1613102 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| Nacl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293-250G | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625-250G | |
| Bacteriological agar | Sigma-Aldrich | A5306-1KG | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615-25G | |
| Spectinomycin sulfate | Sigma-Aldrich | PHR1441 | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Bacteriological peptone | Sigma-Aldrich | P0556 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Nalidixic acid | Sigma-Aldrich | N8878 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Gel loading solution | Sigma-Aldrich | G7654 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Thermocycler | Veriti Thermal Cycler | 4375786 | |
| Centrifuge | Sigma | Sigma 1-14K | |
| Gel documentation unit | Carestream | Gel Logic 212 PRO | |
| MaxQ SHKE6000 6000 Shaking Incubator – 115VAC | Thermo scientific | EW-51708-70 | |
| Plant growth chamber | MRC | PGI-550RH | |
| Horizantal laminarair flow cabinate | Lumistell | LH-120 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM4500 B | |
| Petridish | sym laboratorios | 90X15 | |
| Scalpel Blade | Fisher scientific | 53223 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| 22 mL glass tubes | Thomas scientific | 45048-16150 |
References
- Hernández-Garcia, C. M., Finer, J. J. Identification and validation of promoters and cis-actingregulatory elements. Plant Science. 217-218, 109-119 (2014).
- Dhanapal, A. P., Govindaraj, M. Unlimited Thirst for Genome Sequencing, Data Interpretation, and Database Usage in Genomic Era: The Road towards Fast-Track Crop Plant Improvement. Genetics Research International. , 684321 (2015).
- Nanjareddy, N., Arthikala, M. K., Blanco, L., Arellano, E. S., Lara, M. Protoplast isolation, transient transformation of leaf mesophyll protoplasts and improved Agrobacterium-mediated leaf disc infiltration of Phaseolus vulgaris: Tools for rapid gene expression analysis. BMC Biotechnol. 16 (1), 53 (2016).
- Pumplin, N., Zhang, X., Noar, R. D., Harrison, M. J. Polar localization of a symbiosis-specific phosphate transporter is mediated by a transient reorientation of secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (11), E665-E672 (2012).
- Kryvoruchko, I. S., et al. MtSWEET11, a Nodule-Specific Sucrose Transporter of Medicago truncatula. Plant Physiol. 171 (1), 554-565 (2016).
- Suzaki, T., Yano, K., Ito, M., Umehara, Y., Suganuma, N., Kawaguchi, M. Positive and negative regulation of cortical cell division during root nodule development in Lotus japonicus is accompanied by auxin response. Development. 139 (21), 3997-4006 (2012).
- Suzaki, T., et al. Endoreduplication-mediated initiation of symbiotic organ development in Lotus japonicus. Development. 141 (12), 2441-2445 (2014).
- Qin, L., et al. The high-affinity phosphate transporter GmPT5 regulates phosphate transport to nodules and nodulation in soybean. Plant Physiol. 159 (4), 1634-1643 (2012).
- Wang, Z., Panfeng, L., Yan, Y., Chi, Y., Fan, B., Chen, Z. Expression and Functional Analysis of a Novel Group of Legume-specific WRKY and Exo70 Protein Variants from Soybean. Sci Rep. 6, 32090 (2016).
- Montiel, J., et al. A Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene is required for root infection by Rhizobia. Plant Cell Physiol. 53 (10), 1751-1767 (2012).
- Arthikala, M. K., et al. PvRbohB negatively regulates Rhizophagus irregularis colonization in Phaseolus vulgaris. Plant Cell Physiol. 54 (8), 1391-1402 (2013).
- Arthikala, M. K., Sánchez-López, R., Nava, N., Santana, O., Cárdenas, L., Quinto, C. RbohB a Phaseolus vulgaris NADPH oxidase gene, enhances symbiosome number, bacteroid size, and nitrogen fixation in nodules and impairs mycorrhizal colonization. New Phytol. 202 (3), 886-900 (2014).
- Barraza, A., et al. Down-regulation of PvTRE1 enhances nodule biomass and bacteroid number in the common bean. New Phytol. 197 (1), 194-206 (2013).
- Estrada-Navarrete, G., et al. An autophagy-related kinase is essential for the symbiotic relationship between Phaseolus vulgaris and both rhizobia and arbuscular mycorrhizal fungi. Plant Cell. 28 (9), 2326-2341 (2016).
- Nanjareddy, K., et al. A Legume TOR Protein Kinase Regulates Rhizobium Symbiosis and Is Essential for Infection and Nodule Development. Plant Physiol. 172 (3), 2002-2020 (2016).
- Frühling, M., Schröder, G., Hohnjec, N., Pühler, A., Perlick, A. M., Küster, H. The promoter of the Vicia faba L. gene VfEnod12 encoding an early nodulin is active in cortical cells and nodule primordia of transgenic hairy roots of Vicia hirsuta as well as in the prefixing zone II of mature transgenic V. hirsuta root nodules. Plant Science. 160 (1), 67-75 (2000).
- Szabados, L., Ratet, P., Grunenberg, B., de Bruijn, F. J. Functional analysis of the Sesbania rostrata leghemoglobin glb3 gene 5′-upstream region in transgenic Lotus corniculatus and Nicotiana tabacum plants. Plant Cell Online. 2 (10), 973-986 (1990).
- Madsen, L. H., Tirichine, L., Jurkiewicz, A., Sullivan, J. T., Heckmann, A. B., Bek, A. S., Ronson, C. W., James, E. K., Stougaard, J. The molecular network governing nodule organogenesis and infection in the model legume Lotus japonicus. Nat Commun. 12, 1-10 (2010).
- Montiel, J., Arthikala, M. K., Quinto, C. Phaseolus vulgaris RbohB functions in lateral root development. Plant Signal Behav. 8 (1), 1-3 (2013).
- Nanjareddy, K., Arthikala, M. K., Gómez, B. M., Blanco, L., Lara, M. Differentially expressed genes in mycorrhized and nodulated roots of common bean are associated with defense, cell wall architecture, N metabolism, and P metabolism. PLoS ONE. 12 (8), e0182328 (2017).
- Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. Gateway vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
- Broughton, W. J., Dilworth, M. J. Control of leghemoglobin synthesis in snake beans. Biochem J. 125 (4), 1075-1080 (1971).
- Jefferson, R. A. Assaying chimeric genes in plants, the GUS gene fusion system. Plant Mol Biol Rep. 5 (4), 387-405 (1987).
- Cho, H. J., Farrand, S. K., Noel, G. R., Widholm, J. M. High-efficiency induction of soybean hairy roots and propagation of the soybean cyst nematode. Planta. 210 (2), 195-204 (2000).
- Deng, Y., Mao, G., Stutz, W., Yu, O. Generation of Composite Plants in Medicago truncatula used for Nodulation Assays. J. Vis. Exp. (49), e2633 (2011).
- Kumagai, H., Kouchi, H. Gene silencing by expression of hairpin RNA in Lotus japonicus roots and root nodules. Mol Plant Microbe Interact. 16 (8), 663-668 (2003).
- Okamoto, S., Yoro, E., Suzaki, T., Kawaguchi, M. Hairy Root Transformation in Lotus japonicus. Bio-protocol. 3 (12), e795 (2013).
- Jacobs, T. B., Martin, G. B. High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots. J. Vis. Exp. (110), e53843 (2016).
- Estrada-Navarrete, G., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformation of the Phaseolus spp.: a tool for functional genomics. Mol Plant Microbe Interact. 19 (12), 1385-1393 (2006).
