סינתזה של Bacteriophages זיהומיות e. coli -תא ללא ביטוי מערכת מבוססת
Summary
דור חדש של פלטפורמות תרגום תמלול חופשי תא תוכנן לבנות מערכות ביוכימיות במבחנה באמצעות הביצוע של ג’ין מעגלים. במאמר זה, אנו מתארים איך הם bacteriophages, כגון MS2, ΦΧ174 ו- T7, מסונתז מן הגנום שלהם באמצעות e. coli כל ללא תא TXTL המערכת.
Abstract
דור חדש של מערכות ללא תא תמלול-תרגום (TXTL), מתוכנן יש רב-תכליתיות גדולה יותר, מודולריות, לספק יכולות הרומן לבצע מדעי בסיסי ויישומי בתגובות מבחנה. בעשור האחרון, ללא תא TXTL הפך טכניקה חזקה עבור מגוון רחב של מחקר רב תחומי חדשניים בתחומים הקשורים כמותיים וסינתטיים ביולוגיה. פלטפורמות חדשות TXTL שימושיים בעיקר לבנות ולחקור מערכות הביוכימי דרך הביצוע של מעגלים ג’ין סינטטי או טבעי. במבחנה TXTL הוכיחה נוח במהירות רכיבי רגולטוריות אב-טיפוס, רשתות ביולוגיות כמו גם באשר לסכם מולקולרית הרכבה עצמית מנגנונים נמצאו במערכות החיים. במאמר זה, אנו מתארים איך זיהומיות bacteriophages, כגון MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA), ו- T7 (dsDNA), הם לגמרי מסונתז מן הגנום שלהם בתגובות סיר אחד באמצעות של Escherichia coliכל, ללא תאים של מערכת TXTL. סינתזה של coliphages שלושה זה לכמת באמצעות וזמינותו פלאק. אנו מראים איך התשואה של phage מסונתז תלוי בהגדרות הביוכימי של התגובות. הצפיפות המולקולרית, מדומה דרך ריכוז מבוקר של פג 8000, משפיעה על כמות phages מסונתז על ידי הוראותיו של מגניטודות. אנו נסביר גם כיצד להגביר את phages ואיך לטהר את הגנום שלהם. קבוצת פרוטוקולים ותוצאות הציג בעבודה זו צריך להיות עניין רב תחומיים החוקרים המעורבים ב ביולוגיה סינתטית ללא תא וב בביו-הנדסה.
Introduction
בעשור האחרון, הטכנולוגיה ביטוי נטולת תא מהונדס כתובת יישומים חדשניים בביולוגיה הקשור סינטתיים, כמותיים אזורי מחקר רב-תחומיים מתהווה. השתמשו במקור לבטא חלבונים עצמאית של אורגניזם חי, מערכות TXTL נטול תאים חדשים פותחו שני מדעי בסיסי ויישומי1,2, מרחיבה משמעותית את ההיקף בטכנולוגיה זו. הדור החדש של פלטפורמות TXTL תוכנן להיות ידידותי למשתמש, יעיל יותר (בדרך להשגת 2 מ”ג/מ”ל של סינתזת חלבונים אצווה מצב3), יותר ברמה של שעתוק4, ועם זאת מודולרי על מנת לשלב בקלות הרומן טבעי או פונקציות סינתטי להרחיב את היכולות של מערכות ביולוגיות קיימות5,6. בפרט, ללא תא TXTL מערכות הפכו להיות שימושי עבור שטנץ מהירה של תוכניות גנטי, כגון גורמים רגולטוריים או המעגלים גנטי קטן7,8,9, על-ידי הפחתת העיצוב-לבנות-המבחן מחזור מספר ימים. למרבה הפלא, המערכות TXTL חדש גם הם מסוגלים עיבוד תוכניות דנ א גדולים כגון הסינתזה מלאה של coliphages10,11, הוכחת חזקה מספיק הופעות כדי לתמוך את בנייתו מחדש של פעיל גנומית ה-DNA מקודד ישויות החיים.
TXTL מערכות להציג יתרונות טכניים רבים לעומת המסורתי במבחנה בונה הביוכימי מבחני. ללא תא TXTL מקשר את התהליך של ביטוי גנים המוצר הסופי בסביבה מופחתת ופתוח, בניגוד הציטופלסמה מורכבת של תא חי. TXTL משתמש דנ א כדי לשחזר מערכות ביוכימיות במבחנה, באמצעות טכניקות מודרניות של מכלול ה-DNA, וזה, במחיר נוח, מהיר בנוסף לדרישה לא בררן חלבון טיהור צעדים. תא ללא ביטוי מספקת גישה ישירה אל רוב הרכיבים השונים תגובות ביוכימיות, ובכך מאפשר ניתוח עמוק יותר אינטראקציות מולקולרית12. בתגובה TXTL, אחד באפשרותך לשנות את ההגדרות הביוכימי, ביופיזיקלי כרצונו, שבו כמעט בלתי אפשרי בתא החי. לאור יתרונות ושיפורים אחרונים אלה, הטכנולוגיה TXTL הופכת לפופולרית יותר ויותר כמו פלטפורמה חלופי עבור ביולוגיה סינתטית ולא כמותית. בעוד קהילת המחקר באמצעות TXTL מתפתחת במהירות, TXTL הופך להיות טכנולוגיה סטנדרטית בביו-הנדסה, זה חיוני כדי להבין כיצד משתמשים כזה פלטפורמות כדי לפתח נאותה שהיו קשורים ההוצאה להורג של תגובות TXTL ולחוות פרשנות של התוצאות.
במאמר זה, אנו מסבירים כיצד להשתמש במערכת TXTL כל של החיידק לסנתז, בתגובות סיר אחד, bacteriophages מ שלהם הגנום11, כגון MS2 (RNA, 3.4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5.4 kb), ו- T7 (dsDNA, 40 kb). אנו מראים איך כמות phages מסונתז שינויים ביחס כמה הגדרות הביוכימי של התגובות (ריכוזים מגנזיום ואשלגן). הצפיפות המולקולרית, מדומה דרך ריכוזים טווח של פג 8000, יש השפעה דרמטית על סינתזה phage במספר סדרי גודל. מימוש מערכות הביוכימי גדולים כאלה בתגובות מבחנה אחת אשר מסכם את הדברים במקביל את התהליכים של תמלול, תרגום, הרכבה עצמית, מעניין למיעון שאלות בסיסיות הקשורות לביולוגיה וביופיזיקה 10 (הכונה הרכבה עצמית), כמו גם עבור פיתוח יישומים, כגון שינוי פונקציות phage לבנות nanostructures חדש13. בנוסף מעשית על TXTL, אנו מספקים שיטות phage הגברה, חילוץ הגנום, טיהור של כימות phage מאת וזמינותו פלאק. השיטות שהוצגו בכתב היד מתאימים לחוקרים להשתמש במערכות ללא תא תמצית מבוסס e. coli , מעוניינים bacteriophages.
הפרוטוקולים הציג בעבודה זו ניתן לסכם כדלקמן: 1) Phage הגברה (יום 1: להכין חיסון תאי, יום 2: יחיד פלאק, מרובים phage צמיחה, ואת לריכוז יום 3: טיהור של phage), 2) מיצוי DNA הגנום גדילי כפול (פנול/כלורופורם מיצוי), ו-3) ללא תא התגובה phage וניסוי כייל נוגדנים (יום 1: צלחת התאים המארחים ולעשות פלטות אגר, יום 2: התגובה ללא תא ומנחה תא תרבות קדם, ו יום 3: מארח תא phage ותרבות כייל נוגדנים).
Protocol
Representative Results
Discussion
בעקבות הטכניקה חן, et al. 14 עבור SPMC, שלב קריטי נגיש בקביעת תנאי נאותה superinfection. הפרמטר השולט ביותר היכולת של זן מארח לעמוד superinfection הוא לעתים קרובות הריכוז ההתחלתי של phage המזהם. התאים מארח חייב להיות בשלב הצמיחה לוגריתמי לפני זיהום ראשוני עם כמות קטנה מאוד של phage. בסופו של דבר, pha…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
חומר זה מבוסס על עבודה נתמכת על-ידי Office של המחקר הימי פרס מספר N00014-13-1-0074 (V.N.), תוכנית המדע הגבול האנושי להעניק מספר RGP0037/2015 (V.N.), הקרן הדו-לאומית למדע להעניק 2014400 (V.N.).
Materials
| Ultracentrifugation tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| Conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Gradient maker | BioComp Gradient Master | see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9. | |
| Syringe and Blunt Cannula | Monoject | 8881513918 and 888202017 | |
| Wide-bore pipette tips | Fischerbrand | 02-707-134 | |
| Plaque counter | New Brunswik Scientific | Colony Counter Model C-110 | |
| Culture tubes | Fischerbrand | 14-961-33 | |
| Cell-free system | Mycroarray Inc | Mytxtl | |
| BioComp Gradient Master | BioComp Instruments | Model 105ME | |
| LB agar plate recipe | 25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller – Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company – product number 214010). |
References
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol Adv. , (2011).
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metab Eng. , (2011).
- Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/mL of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
- Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synth Biol. 1 (1), 29-41 (2012).
- Chemla, Y., Ozer, E., Schlesinger, O., Noireaux, V., Alfonta, L. Genetically expanded cell-free protein synthesis using endogenous pyrrolysyl orthogonal translation system. Biotechnol Bioeng. , (2015).
- Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis. Frontiers in Chemistry. 2, (2014).
- Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12672-12677 (2003).
- Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for Rapid Prototyping of Synthetic Biological Circuits in an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free System. Acs Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
- Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. , (2015).
- Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction. ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).
- Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth Biol. , (2016).
- Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system. Phys Rev Lett. 106 (4), 048104 (2011).
- Daube, S. S., Arad, T., Bar-Ziv, R. Cell-free co-synthesis of protein nanoassemblies: tubes, rings, and doughnuts. Nano Lett. 7 (3), 638-641 (2007).
- Chen, X., et al. An immunoblot assay reveals that bacteriophage T4 thymidylate synthase and dihydrofolate reductase are not virion proteins. J Virol. 69 (4), 2119-2125 (1995).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762 (2013).
- Shin, J. N. V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. J Biol Eng. , (2010).
- Caschera, F., Noireaux, V. Preparation of amino acid mixtures for cell-free expression systems. Biotechniques. 58 (1), 40-43 (2015).
- Minton, A. P. How can biochemical reactions within cells differ from those in test tubes. J Cell Sci. 119, 2863-2869 (2006).
- Minton, A. P. Implications of macromolecular crowding for protein assembly. Curr Opin Struct Biol. 10 (1), 34-39 (2000).
- Zimmerman, S. B., Minton, A. P. Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 22, 27-65 (1993).
