大腸菌の伝染性のバクテリオファージの合成による無細胞発現系
Summary
無細胞転写・翻訳プラットフォームの新世代は、生化学システムの in vitro遺伝子回路の実行を構築するために設計されています。この記事で私たちはすべて大腸菌無細胞 TXTL システムを使用して彼らのゲノムからのバクテリオファージ MS2、ΦΧ174、T7 などの合成方法について説明します。
Abstract
試験管反応の基礎および応用科学を実行する新しい機能を提供するより汎用性とモジュール性、エンジニア リング、無細胞転写・翻訳 (TXTL) システムの新世代。過去 10 年間携帯無料 TXTL 斬新な学際的な研究領域定量と合成に関連する生物学の広い範囲のための強力な技術となっています。新しい TXTL プラットフォームは、構築し、合成又は天然の遺伝子回路の実施により生化学システムを尋問すると特に便利です。体外TXTL 実証されています急速にプロトタイプ規制要素と生物学的ネットワーク同様に要約として便利な分子の自己組織化メカニズムは、生活システム。この資料でどのように伝染性のバクテリオファージ、MS2 (RNA)、ΦΧ174 などを述べる (ssDNA) および T7 (dsDNA) 完全すべて大腸菌、無細胞 TXTL 系を用いたワンポット反応で彼らのゲノムから合成されます。3 つの coliphages の合成は、プラクの試金を使用して定量化されます。どのように合成バクテリオファージの収量反応の生化学的設定に依存を示します。ペグの 8000 系の制御された濃度をエミュレート分子クラウディング大きさの命令によって合成されたファージの量に影響します。バクテリオファージを増幅する方法と彼らのゲノムを浄化する方法について述べる。プロトコルとこの作品で示された結果のセットは無細胞合成生物学と工学の学際的な研究者に関心のはずです。
Introduction
過去 10 年間無料のセルの表現技術を創発的学際的な研究領域合成と定量的に関連する生物学の新しいアプリケーションに対応し設計されています。もともと独立した生きている有機体の蛋白質を表現するために使用、新しい携帯無料 TXTL システムは両方基本的な応用科学1、2、かなりこの技術の範囲を広げるために開発されています。TXTL プラットフォームの新世代はユーザーフレンドリーをできるように設計されている効率的 (到達するとバッチ モード3におけるタンパク質合成の 2 mg/mL) より転写4のレベルで汎用性とするようモジュールを簡単に統合自然小説または既存の生物学的システム5,6の機能を拡張する合成関数。特に、携帯無料 TXTL システムとなっている規制要素または小さな遺伝的回路7,8,9などの遺伝的プログラムのラピッドプロトタイピングの便利なデザイン、ビルド、テストを減らすことによって数日サイクルします。驚くことに、新しい TXTL システムは、coliphages10,11, アクティブなゲノムの再構成をサポートする十分な性能を示す強いの完全な合成など大規模な DNA プログラムを処理できます。DNA は、生き物のエンティティがエンコードされます。
TXTL システムは、従来の in vitro建設的な生化学的アッセイに比べて多くの技術的な優位性を提示します。携帯無料 TXTL は、遺伝子発現のプロセスを生きている細胞の複雑な細胞質とは対照的削減とオープン環境で最終製品にリンクします。TXTL では、DNA を利用して、現代 DNA のアセンブリ技術と手頃な価格、気難しいタンパク質精製工程を必要としないに加えて高速生化学システムの in vitro、再構成します。無細胞発現分子間相互作用12の深い郭清をできるように、生化学的な反作用の部品のほとんどへの直接アクセスを提供します。TXTL 反応では、生きている細胞ではほとんど不可能で生化学と生物物理設定変更できます。これらの利点と最近の改善を考えると、TXTL 技術、合成および量的な生物学の代替プラットフォームとして人気が高まってください。それは TXTL 反応の実行に関連する適切なプラクティスを開発するためにこのようなプラットフォームを使用する方法を理解する重要な TXTL を使用して、研究コミュニティは急速に成長しているし、TXTL は、バイオ エンジニア リングの標準的な技術になって、結果の解釈。
この記事での合成、ワンポット反応でバクテリオファージのゲノムから11、MS2 などすべてのエシェリヒア属大腸菌の TXTL システムを使用する方法について説明 (RNA、3.4 kb)、ΦΧ174 (ssDNA、5.4 kb)、および T7 (dsDNA、40 kb)。どのようにファージ量合成反応 (マグネシウムとカリウム濃度) の生化学的な設定の一部に関して変更を示します。ペグ範囲 8000 濃度をエミュレート分子クラウディング バクテリオファージ合成に劇的な効果は、桁違いです。同時に転写、翻訳のプロセスを要約、関連生物学および生物物理学の基本的な質問に対処するための興味深い自己集合、単一試験管反応でこのような大規模な生化学的なシステムの実現10 (遺伝子発現制御、自己集合), だけでなく、新しいナノ構造13を構築するバクテリオファージ関数情報の転用などのアプリケーションを開発します。TXTL の実用的なに加えて我々 はプラクの試金によってバクテリオファージ増幅、ゲノム抽出と精製・ ファージ定量化メソッドを提供します。本稿では提案手法はエシェリヒア属大腸菌の抽出による無細胞システムを使用し、バクテリオファージに興味がある者に適しています。
この作品で提示プロトコルはフォローとしてまとめることができます: 1) バクテリオファージ増幅 (日 1: 接種の準備細胞、2 日目: 単一のプラーク、複数のバクテリオファージの成長と濃度、および 3 日目: バクテリオファージの浄化)、2) 二重座礁させたゲノム DNA の抽出(フェノール/クロロホルム抽出)、3) 携帯無料ファージ反応と抗体実験 (日 1: 宿主細胞をプレートし、寒天プレートを作る 2 日目: 無細胞反応とホスト細胞の前培養と一日 3: ホスト細胞文化およびバクテリオファージ価)。
Protocol
Representative Results
Discussion
次の陳らの手法14 SPMC、重複感染の適切な条件を決定する際の重要なステップは達されます。最も密接にホスト株の重複感染に耐える能力を制御するパラメーターは頻繁に感染しているバクテリオファージの初期濃度です。宿主細胞は、バクテリオファージの非常に少量の初期感染前に対数増殖期でなければなりません。最終的には、バクテリオファージはまた対数増…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この材料は (v. n.) に海軍研究所受賞番号 N00014-13-1-0074 によってサポートされる作業に基づいて、人間科学フロンティア許可番号 RGP0037/2015 (砲兵/ベトナム) と二国間の科学技術振興財団 (v. n.) に 2014400 を与えます。
Materials
| Ultracentrifugation tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| Conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Gradient maker | BioComp Gradient Master | see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9. | |
| Syringe and Blunt Cannula | Monoject | 8881513918 and 888202017 | |
| Wide-bore pipette tips | Fischerbrand | 02-707-134 | |
| Plaque counter | New Brunswik Scientific | Colony Counter Model C-110 | |
| Culture tubes | Fischerbrand | 14-961-33 | |
| Cell-free system | Mycroarray Inc | Mytxtl | |
| BioComp Gradient Master | BioComp Instruments | Model 105ME | |
| LB agar plate recipe | 25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller – Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company – product number 214010). |
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