En protokol til præcist at identificere og analysere synapser i hippocampus skiver bruger immunofluorescens er beskrevet i denne artikel.
I hjernen er synapser specialiserede kryds mellem neuroner, bestemmelse af styrke og spredning af neuronal signalering. Antallet af synapser er stramt reguleret under udvikling og neuronal modning. Vigtigere, kan underskud i synapse antallet føre til kognitiv dysfunktion. Derfor, evaluering af synapse nummer er en integreret del af neurobiologi. Men som synapser er lille og meget kompakt i intakt hjernen, vurdering af absolutte antal er udfordrende. Denne protokol beskriver en metode til nemt at identificere og evaluere synapser i hippocampus gnaver skiver bruger immunofluorescens mikroskopi. Det omfatter en tre-trins procedure for at evaluere synapser i høj kvalitet Konfokal mikroskopi billeder ved at analysere Co lokaliseringen af præ- og postsynaptiske proteiner i hippocampus skiver. Det forklarer også, hvordan analysen udføres og giver repræsentative eksempler fra både excitatoriske og hæmmende synapser. Denne protokol giver et solidt fundament for analyse af synapser og kan anvendes til forskning undersøger strukturen og funktionen af hjernen.
Den menneskelige hjerne består af ca 1014 synapser. Synapse antallet er stramt reguleret under udvikling og modning af det centrale nervesystem (CNS). I hele udvikling, synapse antallet moduleres af synaptogenesis og beskæring til at danne funktionelle neuronal netværk. Indlæring og hukommelse understøttes af reguleringen af synapse antallet og styrke, en proces kendt som synaptic potensering og depression1. Vigtigere, er stabilisering af modne synapser afgørende for at opretholde neuronal netværk slægtskaber. Endvidere er underskud i synapse tæthed blevet rapporteret i de tidlige faser af neurodegenerative sygdomme som Alzheimers sygdom (AD)2. Derfor er evne til præcist at identificere og evaluere synapse antallet fundamental for vurderingen af hjernens fysiologi og patologi.
Ekstrem tæthed og kompakte karakter af synapser gøre det udfordrende for at vurdere deres præcise tal i intakt hjernen områder. Kemiske synapser i CNS er lavet af to neuroner i tæt anbringelsen, adskilt af en synaptiske kløft3. Pre synaptic terminal, eller synaptic bouton, tappes fra en axon og består af akkumulerede blærer, der indeholder neurotransmittere, der definerer specificiteten af en synapse — nemlig glutamat og gamma – aminosmørsyre (GABA) for excitatoriske og hæmmende synapser, henholdsvis. Membraner i vesikler indeholder vesikulære transportvirksomheder specifikke for hver neurotransmitter: vesikulære glutamat transporter (vGlut) for glutamat og vesikulære GABA transporter (vGAT) til GABA. Den post synaptic terminal er en meget tæt struktur, der består af flere proteiner, herunder receptorer, adhæsionsmolekyler, og stillads proteiner. I ophidsende synapser er post synaptic tæthed-95 protein (PSD-95) den mest rigelige stillads protein4, modulerende excitatoriske N-methyl-D-aspartate(NMDA-) og α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syre (AMPA-) receptor funktion, der henviser til, at gephyrin ankre hæmmende receptorer til den hæmmende post synaptic terminal5. Samlet set specificiteten af proteiner til præ- og post synaptic rum støtte i differentiering og identifikation af synapse undertyper.
Evaluering af synapse antallet kan udføres med forskellige teknikker. Den mest almindelige er anvendelsen af elektronmikroskopi (EM), som muliggør analysen af synapse i kompakt og intakt hjernen områder med høj forstørrelse og opløsning. Dog, denne teknik er meget dyrt, kræver kompliceret prøveforberedelse, og er meget tidskrævende. Andre teknikker omfatter brugen af array tomografi6, som har en stor ulempe i, at det kræver specialiserede og dyre udstyr til at udføre analysen. Derudover transgene linjer udtrykker specifikke synaptic markører er nyttig ved vurdering synapse nummer7, men generation af nye linjer kan være restriktive og dyre, og overekspression af proteiner kan resultere i uønskede off-mål fænotyper.
På grund af disse begrænsninger og enkelhed evaluere mange forskere synapse antallet ved at undersøge samlede synaptic protein niveauer. Men synapse tab kan konstateres før væsentlige ændringer i protein, som strukturelle synaptisk remodellering resultater i spredning af præ- eller post synaptic anbringelsen, med ingen forringelse af synaptic proteiner. Derudover i Annoncen er synaptic protein niveauer nedsat følgende synapse degeneration eller neuronal død8,9. Kvantificering af samlede niveauer giver ikke denne skelnen. Der er således behov for at udvikle en pålidelig, tilgængelig og præcis metode til evaluering af synapse antallet i hjernen.
I denne artikel vil beskrive vi sådan grundigt identificere og bestemme antallet af synapser med immunofluorescens mikroskopi i hippocampus gnaver hjernen skiver. Synapser er defineret af colocalization før og efter synaptic markører, der vises i en punktformet fordelingen. Vi påvise gyldigheden af denne teknik gennem studier af Wnt signalering i hjernen. Wnts er udskilles proteiner betydning for dannelse, fjernelse og vedligeholdelse af synapser. I vivo induktion af en udskilles antagonist af Wnt cascade, Dickkopf-1 (Dkk1), fører til excitatoriske synaptic tab samtidig bevare hæmmende synapser i hippocampus10. Vi illustrere identifikation og tælling af excitatoriske og hæmmende synapser i hippocampus skiver fra en voksen mus udtrykker Dkk1 og fremhæve overførsel af denne teknik til andre typer væv/kultur præparater.
Den præcise vurdering af synapse antallet er afgørende inden for neuroscience. Her viser vi hvordan du evaluere tæthed af synapser i regionen CA1 stratum radiatum af hippocampus skiver som et modelsystem. Betydning med hensyn til eksisterende metoder er demonstreret i vores seneste forskning artikel om effekten af Wnt mangel i hippocampus, og hvor vi også evalueret synapse antallet af single-afsnit EM10. Omfanget af synapse tab er ens mellem single-sektion EM og hjerne-skive metode beskrevet her10. Således, denne konstatering viser nøjagtigheden og pålideligheden af teknikken.
Vigtigere, er en begrænsning af både single-sektion EM og immunfarvning synapser, som præsenteres her, den manglende evne til at præcist skøn absolutte synapse antallet for en bestemt hjerne region. Ja, det er vigtigt at identificere globale morfologiske ændringer, som ændringer i samlede volumen kan påvirke synaptic nummer. En anden begrænsning er, at visse antistoffer er mindre effektive på farvning intakt hjerneregioner, delvist på grund af de ekstrem tæthed af synaptiske forbindelser. Vi har oplevet højere kvalitet farvning af vGlut1 og gephyrin ved hjælp af denne skive forberedelse og efterfølgende PFA fiksering til et maksimum på 1 h, i forhold til øjeblikkelig fiksering af hele hjernen i PFA (figur 2 c). Denne førte til klumpet synaptic farvning, med huller i vævet. VGlut1 antistof penetration er dog stadig begrænset i begge metoder (et par snese mikron). Vi overvinde ikke denne begrænsning, selv med øget antistof inkubation, men giver antistof penetration er større end den samlede dybde, der er afbildet, bør der ingen indflydelse på det endelige resultat. Endvidere bør særlige pleje tages til at sikre, at farvning er endda hele hele erhvervet stakken.
I vores undersøgelse ønskede vi at skelne excitatoriske fra hæmmende synapser. Derfor valgte vi vGlut1/PSD-95 og vGAT/gephyrin, henholdsvis, da disse proteiner er stærkt udtrykt i voksen mus hippocampus og er specifikke for hver synapse subtype4,5. Andre excitatoriske og hæmmende synaptic markører kunne have været brugt til at identificere hver respektive synapse, som receptorer beriget på hver synapse, herunder NMDA og AMPA-receptorer for excitatoriske og GABAA-receptorer for hæmmende synapser. Andre neurotransmittere eller neuromodulators kan også identificeres med vores protokol, sikrer, at specifikke antistoffer er tilgængelig, som vist for dopaminerge synapser i striatum22. Derudover kan at reducere tykkelsen af hver skive til 120 µm delvist overvinde det lave antal prøver med akut skiver, som er afgørende for studier i lille hjernestrukturer såsom amygdala.
Fremtidige anvendelser af vores protokollen kunne gennemføres i studiet af forskellige hjernen områder og lidelser. For eksempel i striatum (en region af hjernen er forbundet med Parkinsons sygdom), kan en kombination af vGlut2/PSD-95 eller vGlut1/PSD-95 bruges til at skelne mellem excitatoriske synapser fra afferenter fra cortex eller thalamus, henholdsvis22.
Afslutningsvis har vi vist en pålidelig metode til at undersøge antallet af synapser i hjernen væv ved hjælp af præ- og post synaptic markører til at definere en synapse. Kritiske trin omfatter forberedelse af god hippocampus skiver, gangen fiksering af op til 1 time i PFA, anvendelsen af nok montering medium, brugen af pålidelige antistoffer, passende billede erhvervelse indstillinger og strenge synaptic puncta påvisning. I sidste ende, denne metode er relativt hurtigt og er let at reproducere af alle laboratorier, der har adgang til en Konfokal mikroskop.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af MRC, EU RP7, ARUK, Wellcome Trust og Parkinsons UK. Vi vil også gerne takke Ms. Johanna Buchler for hendes bidrag af Konfokal billeder og medlemmer af lab for deres konstruktive bidrag på manuskriptet og metodologi.
Vibratome | Leica | VT1000S | |
Primary antibody | Millipore | AB5905 | vGlut1 (1:2000) |
Primary antibody | Thermo Scientific | MA1-046 | PSD-95 (1:500) |
Primary antibody | Synaptic Systems | 131 004 | vGAT (1:500) |
Primary antibody | Synaptic Systems | 147011 | Gephyrin (1:500) |
Primary antibody | Abcam | ab5392 | MAP2 (1:10000) |
Secondary antibody | Jackson Laboratories | 706-545-148 | Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600) |
Secondary antibody | Abcam | ab175470 | Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600) |
Mounting medium | SouthernBiotech | 00-4958-02 | Fluoromount-G |
Confocal Microscope | Olympus | NA | FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%. |
Analysis software | PerkinElmer | NA | Volocity |
Scalpel | Swann-Morton | 203 | No 11 |
Super Glue | Loctite | 1446875 | |
95% O2, 5% CO2 | BOC | NA | Cylinder |
24-well plate | Corning | 3524 | |
Glass slides | Thermo | 7107 | 08-1.0mm thick |
Petri Dish | Corning | 430167 | |
iDkk1 mice | N/A | N/A | Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKIIα rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKIIα rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents for solutions: | |||
NaCl | Sigma | V800372 | |
KCl | Sigma | P9333 | |
Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
Ca2Cl | Sigma | 223506 | |
Mg2Cl | Sigma | M9272 | |
NaH2PO4 | Sigma | 71505 | |
Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
EDTA | Sigma | E6758 | |
D-Glucose | Sigma | G5767 | |
Sucrose | Sigma | S8501 | |
Triton-X | Sigma | T8787 | |
Donkey Serum | Millipore | S30-100ml | |
PFA | Sigma | P6148 |