Un protocole détaillé d’un modèle de souris pour entérohémorragique Escherichia coli (EHEC) colonisation en utilisant des bactéries marquées bioluminescence est présenté. La détection de ces bactéries bioluminescentes par un non invasif in vivo d’imagerie système animaux vivants peut avancer notre compréhension actuelle de la colonisation de l’ECEH.
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Article de méthode
Détection de la colonisation de Escherichia Coli entéro-hémorragique en hôte murin par système de Bioluminescence Non invasif In Vivo
Dans cet article
Résumé
Résumé
Entérohémorragique Escherichia coli (EHEC) O157 : H7, qui est un agent pathogène d’origine alimentaire de cette causesdiarrhea, la colite hémorragique (HS), et de syndrome hémolytique et urémique (SHU), coloniser pour le tractus intestinal de l’homme. Pour étudier le mécanisme détaillé de EHEC colonisation in vivo, il est essentiel d’avoir des modèles animaux de surveiller et de quantifier la colonisation ECEH. Nous montrons ici un modèle de colonisation souris-ECEH en transformant le plasmide exprimant bioluminescent à EHEC de surveiller et de quantifier la colonisation ECEH chez les hôtes de la vie. Animaux inoculés avec marqué bioluminescence EHEC affichent des signaux bioluminescentes intenses chez les souris par détection avec un non invasif en vivo système d’imagerie. Après que 1 à 2 jours après l’infection, signaux bioluminescentes pourraient toujours être détectés chez les animaux infectés, ce qui suggère que les EHEC colonisent en hôtes pendant au moins 2 jours. Nous démontrons également que ces EHEC bioluminescentes localiser à l’intestin de souris, plus précisément dans le caecum et le côlon, des images ex vivo . Ce modèle de colonisation souris-EHEC peut servir d’outil pour faire avancer les connaissances actuelles sur le mécanisme de colonisation ECEH.
Introduction
EHEC O157 : H7 est un pathogène qui provoque la diarrhée1, HS2, HUS3et une insuffisance rénale aiguë même4 par contamination de l’eau ou de nourriture. EHEC est un enterobacterium pathogène et colonise dans le tube digestif de l’homme1. Lorsque EHEC a tout d’abord adhérer à l’épithélium intestinal hôte, ils injectent les facteurs de colonisation dans les cellules de l’hôte à travers le système de sécrétion type III (T3SS) qui fonctionne comme une seringue moléculaire induisant une fixation et effacement (A/E) lésion suite à appliquer adhérence (colon....
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Protocole
ATTENTION : EHEC O157 : H7 est un niveau de biosécurité 2 (BSL-2) pathogène selon les Centers for Disease Control and Prevention (CDC) instruction de biosécurité (https://www.cdc.gov/). Par conséquent, toutes les procédures expérimentales impliquant ECEH doivent être effectuées dans un établissement de BSL-2. Porter des gants et blouses tout en exécutant l’expérience. Travailler dans une cabinet de biosécurité certifiée (BSC). Désinfecter le banc expérimental avant et après la procédure expérimentale avec l’éthanol à 70 %. Tous les instruments ou matériel que EHEC contact (ou potentiellement contact) doit être désinfecté avec l’éthanol à 70 % ou l’eau de Javel. Les dé....
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Résultats
Que nous administrons marqué bioluminescence EHEC (~ 109 cellules bactériennes) à des souris C57BL/6 femelles 6 - anciennes semaine par gavage. Après l’inoculation par voie orale d’ECEH chez la souris à 1 h, les animaux ont été examinés pour signal de bioluminescence par le système d’imagerie in vivo comme illustré à la Figure 7. Les résultats ont montré un signal fort de bioluminescent chez des souris de gavage avec marqué bioluminescence.......
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Discussion
Il a été signalé que EHEC transformé avec plasmide de la luciférase a été utilisé pour examiner sa localisation en hôtes ou gene expression in vivo8,11,12. Le modèle murin démontré ici a aussi signalé pour détecter le moment de EHEC colonisé et la localisation dans hôte murine8. Néanmoins, nous fournissons le protocole en détail comment administrer l’inoculation à des souris ECEH par voie intraga.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous reconnaissons Chi-Chung Chen de la Department of Medical Research, Chi Mei Medical Center (Tainan, Taïwan) à l’aide de la souris, maladies infectieuses et le soutien du centre animaux Laboratoire National Cheng Kung University. Ce travail est soutenu par le ministre de la Science et la technologie (MOST) accorde (plus 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006-011,-005 and106-2321-B-006) aux CC.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Incubateur à agitateur | YIH DER | LM-570R | incubation de bactéries ; |
| Incubateur à secousses orbitales | FIRSTEK | S300 | incubation de bactéries ; |
| pBSL180 | source du gène nptII | ||
| pAKlux2 | source de luxCDABE opéron | ||
| T& Un kit de clonage | Yeastern Biotech | FYC001-20P | à utiliser pour le clonage TA |
| Nsi I | NEB | R0127S | utilisation pour le clonage de plasmides ; |
| Sca I | NEB | R0122S | utilisation pour le clonage de plasmides ; |
| Spe I-HF | NEB | R0133S | utilisation pour le clonage de plasmides ; |
| Sma Je | Utilisation du NEB | R0141S | pour le clonage de plasmides ; |
| T4 ligase | NEB | M0202S | pour le clonage de plasmides ; |
| Ex Taq | TaKaRa | RR001A | utilisation pour l’amplification PCR |
| 10X Ex Taq Buffer | TaKaRa | RR001A | utilisation pour l’amplification |
| PCR dNTP Mixture ; | TaKaRa | RR001A | utilisation pour l’amplification PCR |
| Machine PCR | appliquée Biosystem ; | 2720 Thermocycleur ; | ; pour l’amplification par PCR |
| Glycérol | SIGMA | G5516-1L | à utiliser pour la solution de stockage de bactéries |
| NaCl | Sigma | 31434-5KG-R | produit chimique pour la fabrication du milieu LB, 10 g/L |
| Tryptone | CONDA pronadisa | Cat 1612.00 | Produit chimique pour la fabrication du milieu LB, 10 g/L |
| Poudre d’extrait de levure | Affymetrix | 23547-1 KG | Produit chimique pour la fabrication du milieu LB, 5 g/L |
| Agar | CONDA pronadisa | Cat 1802.00 | produit chimique pour la fabrication de la gélose LB |
| kanamycine ; | Antibiotiques Sigma | K4000-5G | , à utiliser pour la séléciton |
| streptomycine ; | Antibiotiques Sigma | S6501-100G | , éliminer le microbiote chez la souris |
| EDL933 cellule compétente | La méthode maison | est sur le document supplémentaire ; | |
| Électroporateur | MicroPulser | pour électroporation | |
| Cuvettes d’électroporation | Gene Pulser/MicroPulser | 1652086 | pour électroporation |
| Centrifugeuse à grande vitesse | Beckman Coulter | Avanti, J-26S XP | utilisation pour la centrifugation des bactéries ; |
| Rotor à angle fixe | Beckman Coulter | JA25.5 | pour la centrifugation des bactéries ; |
| Rotor à angle fixe | Beckman Coulter | JLA10.5 | pour la centrifugation des bactéries ; |
| bouteilles centrifuges | Beckman Coulter | REF357003 | utilisation pour la centrifugation des bactéries ; |
| bouteilles centrifuges | Thermo Fisher scientific | 3141-0500 | utilisation pour la centrifugation des bactéries ; |
| Biophotomètre Eppendorf Plus ; | eppendorf | AG 22331 hambourg | pour la mesure de la valeur OD600 des |
| souris C57BL/6 | Blouse de laboratoire du Centre des animaux de laboratoire du NCKU | ||
| , gants | pour la protection du personnel. | ||
| isoflurane ; | Panion & BF Biotech Inc. | G-8669 | pour anesthésie de souris, |
| seringue de 1 ml | utilisation pour le gavage oral de souris | ||
| Aiguille d’alimentation réutilisable à pointe sphérique de 22 G | 0,9 mm X L 50 mm | à utiliser pour le gavage oral de souris | |
| utilisation pour l’expérience sur les souris | |||
| Système d’imagerie Xenogen IVIS 200 | Perkin Elmer | IVIS | utilisation pour la capture d’images bioluminescentes ; |
| Logiciel d’image vivante | Perkin Elmer | version 4.1 | à utiliser pour quantifier les données d’image |
Références
- Pennington, H. Escherichia coli O157. Lancet. 376 (9750), 1428-1435 (2010).
- Mayer, C. L., Leibowitz, C. S., Kurosawa, S., Stearns-Kurosawa, D. J. Shiga toxins and the pathophysiology of hemolytic uremic syndrome in humans and animals. Toxins (Basel). 4 (11), 1261-1287 (2012).
- Tarr, P. I., Gord....
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Réimpressions et autorisations
